Microscopio - Microscope

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Microscopio
Microscopio compuesto (recortado) .JPG
Microscopio
Usos Observación de muestras pequeñas
Experimentos notables Descubrimiento de células
Artículos relacionados Microscopio óptico Microscopio electrónico

Un microscopio (del griego antiguo : μικρός , mikrós , "pequeño" y σκοπεῖν , skopeîn , "mirar" o "ver") es un instrumento de laboratorio que se utiliza para examinar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista . La microscopía es la ciencia de investigar pequeños objetos y estructuras utilizando un microscopio. Microscópico significa ser invisible a los ojos a menos que sea ayudado por un microscopio.

Hay muchos tipos de microscopios y se pueden agrupar de diferentes formas. Una forma es describir el método que utiliza un instrumento para interactuar con una muestra y producir imágenes, ya sea enviando un haz de luz o electrones a través de una muestra en su trayectoria óptica , detectando emisiones de fotones de una muestra o escaneando a través de una muestra. a poca distancia de la superficie de una muestra utilizando una sonda. El microscopio más común (y el primero en ser inventado) es el microscopio óptico , que usa lentes para refractar la luz visible que pasa a través de una muestra finamente seccionada para producir una imagen observable. Otros tipos importantes de microscopios son el microscopio de fluorescencia , el microscopio electrónico (tanto el microscopio electrónico de transmisión como el microscopio electrónico de barrido ) y varios tipos de microscopios de sonda de barrido .

Historia

Microscopios del siglo XVIII del Musée des Arts et Métiers , París

Aunque los objetos que se asemejan a lentes se remontan a 4.000 años y hay relatos griegos de las propiedades ópticas de las esferas llenas de agua (siglo V a.C.) seguidas de muchos siglos de escritos sobre óptica, el primer uso conocido de microscopios simples ( lupas ) se remonta a el uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. Los primeros ejemplos conocidos de microscopios compuestos, que combinan una lente de objetivo cerca de la muestra con un ocular para ver una imagen real , aparecieron en Europa alrededor de 1620. Se desconoce el inventor, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Varios giran en torno a los centros de fabricación de espectáculos en los Países Bajos, incluidas las afirmaciones de que fue inventado en 1590 por Zacharias Janssen (afirmación hecha por su hijo) y / o el padre de Zacharias, Hans Martens, afirma que fue inventado por su vecino y rival fabricante de gafas. Hans Lippershey (quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608), y afirma que fue inventado por el expatriado Cornelis Drebbel, quien se notó que tenía una versión en Londres en 1619. Galileo Galilei (también citado a veces como inventor del microscopio compuesto) parece haber encontrado después de 1610, pudo enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños y, después de ver un microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, construyó su propia versión mejorada. Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1625 (Galileo lo había llamado " occhiolino " u " ojo pequeño ").

Auge de los microscopios ópticos modernos

Microscopio compuesto binocular Carl Zeiss, 1914

El primer relato detallado de la anatomía microscópica del tejido orgánico basado en el uso de un microscopio no apareció hasta 1644, en L'occhio della mosca de Giambattista Odierna , o El ojo de la mosca .

El microscopio siguió siendo en gran medida una novedad hasta las décadas de 1660 y 1670, cuando los naturalistas de Italia, los Países Bajos e Inglaterra comenzaron a usarlos para estudiar biología. El científico italiano Marcello Malpighi , llamado el padre de la histología por algunos historiadores de la biología, comenzó su análisis de las estructuras biológicas con los pulmones. La publicación en 1665 de Robert Hooke 's micrografía tuvo un gran impacto, en gran parte debido a sus impresionantes ilustraciones. Una contribución significativa provino de Antonie van Leeuwenhoek, quien logró un aumento de hasta 300 veces utilizando un simple microscopio de lente única. Colocó una lente de bola de vidrio muy pequeña entre los orificios de dos placas de metal remachadas juntas, y con una aguja ajustable mediante tornillos adjunta para montar la muestra. Luego, Van Leeuwenhoek redescubrió los glóbulos rojos (después de Jan Swammerdam ) y los espermatozoides , y ayudó a popularizar el uso de microscopios para ver la ultraestructura biológica. El 9 de octubre de 1676, van Leeuwenhoek informó del descubrimiento de microorganismos.

El rendimiento de un microscopio óptico depende de la calidad y el uso correcto del sistema de lentes de condensador para enfocar la luz en la muestra y la lente del objetivo para capturar la luz de la muestra y formar una imagen. Los primeros instrumentos fueron limitados hasta que este principio fue plenamente apreciado y desarrollado desde finales del siglo XIX hasta principios del siglo XX, y hasta que las lámparas eléctricas estuvieron disponibles como fuentes de luz. En 1893, August Köhler desarrolló un principio clave de iluminación de muestras, la iluminación de Köhler , que es fundamental para alcanzar los límites teóricos de resolución del microscopio óptico. Este método de iluminación de muestra produce una iluminación uniforme y supera el contraste y la resolución limitados impuestos por las primeras técnicas de iluminación de muestra. Otros desarrollos en la iluminación de muestra provienen del descubrimiento del contraste de fase por Frits Zernike en 1953, y la iluminación de contraste de interferencia diferencial por Georges Nomarski en 1955; ambos permiten obtener imágenes de muestras transparentes sin teñir.

Microscopios electronicos

Microscopio electrónico construido por Ernst Ruska en 1933.

A principios del siglo XX se desarrolló una alternativa significativa al microscopio óptico, un instrumento que utiliza un haz de electrones en lugar de luz para generar una imagen. El físico alemán Ernst Ruska , en colaboración con el ingeniero eléctrico Max Knoll , desarrolló el primer prototipo de microscopio electrónico en 1931, un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El microscopio electrónico de transmisión funciona con principios similares a los de un microscopio óptico, pero utiliza electrones en lugar de luz y electroimanes en lugar de lentes de vidrio. El uso de electrones, en lugar de luz, permite una resolución mucho mayor.

El desarrollo del microscopio electrónico de transmisión fue seguido rápidamente en 1935 por el desarrollo del microscopio electrónico de barrido por Max Knoll . Aunque los TEM se utilizaban para la investigación antes de la Segunda Guerra Mundial y se hicieron populares después, el SEM no estuvo disponible comercialmente hasta 1965.

Los microscopios electrónicos de transmisión se hicieron populares después de la Segunda Guerra Mundial . Ernst Ruska, que trabaja en Siemens , desarrolló el primer microscopio electrónico de transmisión comercial y, en la década de 1950, comenzaron a celebrarse importantes conferencias científicas sobre microscopía electrónica. En 1965, el profesor Sir Charles Oatley y su estudiante de posgrado Gary Stewart desarrollaron el primer microscopio electrónico de barrido comercial , y la Cambridge Instrument Company lo comercializó como "Stereoscan".

Uno de los últimos descubrimientos realizados sobre el uso de un microscopio electrónico es la capacidad de identificar un virus. Dado que este microscopio produce una imagen clara y visible de pequeños orgánulos, en un microscopio electrónico no hay necesidad de reactivos para ver el virus o las células dañinas, lo que resulta en una forma más eficiente de detectar patógenos.

Microscopios de sonda de barrido

De 1981 a 1983, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer trabajaron en IBM en Zúrich , Suiza , para estudiar el fenómeno de los túneles cuánticos . Crearon un instrumento práctico, un microscopio de sonda de barrido a partir de la teoría de los túneles cuánticos, que lee las fuerzas muy pequeñas intercambiadas entre una sonda y la superficie de una muestra. La sonda se acerca a la superficie tan cerca que los electrones pueden fluir continuamente entre la sonda y la muestra, generando una corriente de superficie a sonda. El microscopio no fue bien recibido inicialmente debido a la naturaleza compleja de las explicaciones teóricas subyacentes. En 1984 Jerry Tersoff y DR Hamann, mientras trabajaban en los Bell Laboratories de AT&T en Murray Hill, Nueva Jersey, comenzaron a publicar artículos que relacionaban la teoría con los resultados experimentales obtenidos por el instrumento. Esto fue seguido de cerca en 1985 con instrumentos comerciales en funcionamiento, y en 1986 con la invención del microscopio de fuerza atómica de Gerd Binnig, Quate y Gerber , luego el Premio Nobel de Física de Binnig y Rohrer por el SPM.

Se han seguido desarrollando nuevos tipos de microscopios de sonda de barrido a medida que avanzaba la capacidad de mecanizar puntas y sondas ultrafinas.

Microscopios de fluorescencia

Microscopio de fluorescencia con la torreta del cubo de filtro encima de las lentes del objetivo, junto con una cámara.

Los desarrollos más recientes en microscopía óptica se centran en gran medida en el aumento de la microscopía de fluorescencia en biología . Durante las últimas décadas del siglo XX, particularmente en la era postgenómica , se desarrollaron muchas técnicas para la tinción fluorescente de estructuras celulares . Los principales grupos de técnicas implican la tinción química dirigida de estructuras celulares particulares, por ejemplo, el compuesto químico DAPI para marcar el ADN , el uso de anticuerpos conjugados con indicadores fluorescentes, ver inmunofluorescencia y proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente . Estas técnicas utilizan estos diferentes fluoróforos para el análisis de la estructura celular a nivel molecular tanto en muestras vivas como fijas.

El aumento de la microscopía de fluorescencia impulsó el desarrollo de un importante diseño de microscopio moderno, el microscopio confocal . El principio fue patentado en 1957 por Marvin Minsky , aunque la tecnología láser limitó la aplicación práctica de la técnica. No fue hasta 1978 cuando Thomas y Christoph Cremer desarrollaron el primer microscopio de escaneo láser confocal práctico y la técnica ganó popularidad rápidamente a lo largo de la década de 1980.

Microscopios de súper resolución

Gran parte de la investigación actual (a principios del siglo XXI) sobre técnicas de microscopio óptico se centra en el desarrollo de análisis de superresolución de muestras marcadas con fluorescencia. La iluminación estructurada puede mejorar la resolución entre dos y cuatro veces y técnicas como la microscopía de reducción de emisión estimulada (STED) se están acercando a la resolución de los microscopios electrónicos. Esto ocurre porque el límite de difracción se produce por la luz o la excitación, lo que hace que la resolución deba duplicarse para quedar súper saturada. Stefan Hell recibió el Premio Nobel de Química 2014 por el desarrollo de la técnica STED, junto con Eric Betzig y William Moerner, quienes adaptaron la microscopía de fluorescencia para la visualización de una sola molécula.

Microscopios de rayos x

Los microscopios de rayos X son instrumentos que utilizan radiación electromagnética generalmente en la banda de rayos X suave para obtener imágenes de objetos. Los avances tecnológicos en la óptica de lentes de rayos X a principios de la década de 1970 hicieron del instrumento una opción de imagen viable. A menudo se utilizan en tomografía (ver micro tomografía computarizada ) para producir imágenes tridimensionales de objetos, incluidos materiales biológicos que no se han fijado químicamente. Actualmente se están realizando investigaciones para mejorar la óptica de los rayos X duros que tienen mayor poder de penetración.

Tipos

Tipos de microscopios ilustrados por los principios de sus trayectorias de haz
Evolución de la resolución espacial lograda con microscopios ópticos, de transmisión (TEM) y electrónicos con corrección de aberraciones (ACTEM).

Los microscopios se pueden dividir en varias clases diferentes. Una agrupación se basa en lo que interactúa con la muestra para generar la imagen, es decir, luz o fotones (microscopios ópticos), electrones (microscopios electrónicos) o una sonda (microscopios de sonda de barrido). Alternativamente, los microscopios se pueden clasificar en función de si analizan la muestra a través de un punto de escaneo (microscopios ópticos confocales, microscopios electrónicos de barrido y microscopios de sonda de barrido) o analizan la muestra de una sola vez (microscopios ópticos de campo amplio y microscopios electrónicos de transmisión).

Tanto los microscopios ópticos de campo amplio como los microscopios electrónicos de transmisión utilizan la teoría de las lentes ( óptica para microscopios ópticos y lentes electromagnéticos para microscopios electrónicos) para ampliar la imagen generada por el paso de una onda transmitida a través de la muestra o reflejada por la muestra. Las ondas utilizadas son electromagnéticas (en microscopios ópticos ) o haces de electrones (en microscopios electrónicos ). La resolución en estos microscopios está limitada por la longitud de onda de la radiación utilizada para obtener imágenes de la muestra, donde las longitudes de onda más cortas permiten una resolución más alta.

Los microscopios ópticos y electrónicos de barrido, como el microscopio confocal y el microscopio electrónico de barrido, usan lentes para enfocar un punto de luz o electrones en la muestra y luego analizan las señales generadas por el haz que interactúa con la muestra. Luego, el punto se escanea sobre la muestra para analizar una región rectangular. La ampliación de la imagen se logra mostrando los datos del escaneo de un área de muestra físicamente pequeña en una pantalla relativamente grande. Estos microscopios tienen el mismo límite de resolución que los microscopios electrónicos, de sonda y ópticos de campo amplio.

Los microscopios de sonda de barrido también analizan un solo punto en la muestra y luego escanean la sonda sobre una región de muestra rectangular para construir una imagen. Como estos microscopios no utilizan radiación electromagnética o de electrones para obtener imágenes, no están sujetos al mismo límite de resolución que los microscopios ópticos y electrónicos descritos anteriormente.

Óptico

El tipo de microscopio más común (y el primero que se inventó) es el microscopio óptico . Este es un instrumento óptico que contiene una o más lentes que producen una imagen ampliada de una muestra colocada en el plano focal. Los microscopios ópticos tienen vidrio refractivo (ocasionalmente plástico o cuarzo ), para enfocar la luz en el ojo o en otro detector de luz. Los microscopios ópticos basados ​​en espejos funcionan de la misma manera. El aumento típico de un microscopio óptico, asumiendo un rango de luz visible, es de hasta 1250x con un límite de resolución teórico de alrededor de 0,250  micrómetros o 250  nanómetros . Esto limita el aumento práctico a ~ 1500x. Las técnicas especializadas (p. Ej., Microscopía confocal de barrido , Vertico SMI ) pueden superar este aumento, pero la resolución es limitada por difracción . El uso de longitudes de onda de luz más cortas, como la ultravioleta, es una forma de mejorar la resolución espacial del microscopio óptico, al igual que los dispositivos como el microscopio óptico de barrido de campo cercano .

Sarfus es una técnica óptica reciente que aumenta la sensibilidad de un microscopio óptico estándar hasta un punto en el que es posible visualizar directamente películas nanométricas (hasta 0,3 nanómetros) y nanoobjetos aislados (hasta 2 nm de diámetro). La técnica se basa en el uso de sustratos no reflectantes para microscopía de luz reflejada con polarización cruzada.

La luz ultravioleta permite la resolución de características microscópicas, así como la obtención de imágenes de muestras que son transparentes para el ojo. La luz del infrarrojo cercano se puede utilizar para visualizar circuitos integrados en dispositivos de silicio enlazados, ya que el silicio es transparente en esta región de longitudes de onda.

En microscopía de fluorescencia, se pueden usar muchas longitudes de onda de luz que van desde el ultravioleta al visible para hacer que las muestras emitan fluorescencia , lo que permite verlas a simple vista o con cámaras específicamente sensibles.

Células no teñidas vistas por campo claro típico (izquierda) en comparación con microscopía de contraste de fase (derecha).

La microscopía de contraste de fase es una técnica de iluminación de microscopía óptica en la que pequeños cambios de fase en la luz que pasa a través de una muestra transparente se convierten en cambios de amplitud o contraste en la imagen. El uso de contraste de fase no requiere tinción para ver la diapositiva. Esta técnica de microscopio permitió estudiar el ciclo celular en células vivas.

El microscopio óptico tradicional ha evolucionado más recientemente hacia el microscopio digital . Además de, o en lugar de, ver directamente el objeto a través de los oculares , se utiliza un tipo de sensor similar a los utilizados en una cámara digital para obtener una imagen, que luego se muestra en un monitor de computadora. Estos sensores pueden utilizar tecnología CMOS o de dispositivo de carga acoplada (CCD), según la aplicación.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños en muestras biológicas vulnerables está disponible utilizando cámaras digitales sensibles con conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporcione pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de dañar las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales se correlaciona espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones.

Microscopio electrónico de transmisión moderno

Electrón

Micrografía electrónica de transmisión de una célula en división que experimenta citocinesis

Los dos tipos principales de microscopios electrónicos son los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y los microscopios electrónicos de barrido (SEM). Ambos tienen una serie de lentes electromagnéticos y electrostáticos para enfocar un haz de electrones de alta energía en una muestra. En un TEM, los electrones pasan a través de la muestra, de forma análoga a la microscopía óptica básica . Esto requiere una preparación cuidadosa de la muestra, ya que la mayoría de los materiales dispersan fuertemente los electrones. Las muestras también deben ser muy delgadas (por debajo de 100 nm) para que los electrones pasen a través de ellas. Las secciones transversales de células teñidas con osmio y metales pesados ​​revelan membranas de orgánulos transparentes y proteínas como los ribosomas. Con un nivel de resolución de 0,1 nm, se pueden obtener vistas detalladas de virus (20 - 300 nm) y una hebra de ADN (2 nm de ancho). Por el contrario, el SEM tiene bobinas de trama para escanear la superficie de objetos a granel con un haz de electrones fino. Por lo tanto, no es necesario seccionar la muestra, pero puede ser necesario un revestimiento con una capa nanométrica de metal o carbono para las muestras no conductoras. SEM permite obtener imágenes rápidas de la superficie de las muestras, posiblemente en vapor de agua fino para evitar el secado.

Sonda de escaneo

Los diferentes tipos de microscopios de sonda de exploración surgen de los muchos tipos diferentes de interacciones que se producen cuando se explora una pequeña sonda e interactúa con una muestra. Estas interacciones o modos pueden registrarse o mapearse en función de la ubicación en la superficie para formar un mapa de caracterización. Los tres tipos más comunes de microscopios de sonda de barrido son los microscopios de fuerza atómica (AFM), los microscopios ópticos de barrido de campo cercano (MSOM o SNOM, microscopía óptica de campo cercano de barrido) y los microscopios de túnel de barrido (STM). Un microscopio de fuerza atómica tiene una sonda fina, generalmente de silicio o nitruro de silicio, unida a un voladizo; la sonda se escanea sobre la superficie de la muestra, y se miden y mapean las fuerzas que causan una interacción entre la sonda y la superficie de la muestra. Un microscopio óptico de barrido de campo cercano es similar a un AFM, pero su sonda consiste en una fuente de luz en una fibra óptica cubierta con una punta que generalmente tiene una abertura para que pase la luz. El microscopio puede capturar luz transmitida o reflejada para medir propiedades ópticas muy localizadas de la superficie, comúnmente de una muestra biológica. Los microscopios de túnel de barrido tienen una punta de metal con un solo átomo apical; la punta está unida a un tubo a través del cual fluye una corriente. La punta se escanea sobre la superficie de una muestra conductora hasta que fluye una corriente de túnel; la corriente se mantiene constante mediante el movimiento informático de la punta y se forma una imagen mediante los movimientos registrados de la punta.

Superficie de la hoja vista por un microscopio electrónico de barrido.

Otros tipos

Los microscopios acústicos de barrido utilizan ondas sonoras para medir variaciones en la impedancia acústica. Al igual que el Sonar en principio, se utilizan para trabajos como la detección de defectos en el subsuelo de los materiales, incluidos los que se encuentran en los circuitos integrados. El 4 de febrero de 2013, los ingenieros australianos construyeron un "microscopio cuántico" que proporciona una precisión incomparable.

Ver también

Referencias

Primer microscopio de fuerza atómica

enlaces externos