Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia - Fluorescence interference contrast microscopy

La microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC) es una técnica microscópica desarrollada para lograr una resolución z en la escala nanométrica.

El FLIC se produce siempre que haya objetos fluorescentes en las proximidades de una superficie reflectante (por ejemplo, una oblea de Si). La interferencia resultante entre la luz directa y reflejada conduce a una modulación doble sen 2 de la intensidad, I, de un objeto fluorescente en función de la distancia, h, por encima de la superficie reflectante. Esto permite las mediciones de altura nanométricas .

El microscopio FLIC es muy adecuado para medir la topografía de una membrana que contiene sondas fluorescentes, por ejemplo, una bicapa lipídica artificial , una membrana de células vivas o la estructura de proteínas marcadas con fluorescencia en una superficie.

Teoría óptica FLIC

Sistema general de dos capas

La teoría óptica subyacente a FLIC fue desarrollada por Armin Lambacher y Peter Fromherz. Derivaron una relación entre la intensidad de fluorescencia observada y la distancia del fluoróforo de una superficie de silicio reflectante .

La intensidad de fluorescencia observada, , es el producto de la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, y la probabilidad de medir un fotón emitido por unidad de tiempo, . Ambas probabilidades son una función de la altura del fluoróforo sobre la superficie del silicio, por lo que la intensidad observada también será una función de la altura del fluoróforo. La disposición más simple a considerar es un fluoróforo incrustado en dióxido de silicio (índice de refracción ) a una distancia d de una interfaz con silicio (índice de refracción ). El fluoróforo es excitado por luz de longitud de onda y emite luz de longitud de onda . El vector unitario da la orientación del dipolo de transición de excitación del fluoróforo. es proporcional a la proyección cuadrado de los locales de campo eléctrico , que incluye los efectos de la interferencia , en la dirección del dipolo de transición. El campo eléctrico local , en el fluoróforo se ve afectado por la interferencia entre la luz incidente directa y la luz que se refleja en la superficie de silicio. La interferencia se cuantifica por la diferencia de fase dada por es el ángulo de la luz incidente con respecto al plano de silicio normal. No solo modula la interferencia , sino que la superficie de silicio no refleja perfectamente la luz incidente. Los coeficientes de Fresnel dan el cambio de amplitud entre una onda incidente y una reflejada. Los coeficientes de Fresnel dependen de los ángulos de incidencia, y , los índices de refracción de los dos medios y la polarización dirección. Los ángulos y pueden relacionarse mediante la Ley de Snell . Las expresiones para los coeficientes de reflexión son: TE se refiere a la componente del campo eléctrico perpendicular al plano de incidencia y TM a la componente paralela (El plano incidente se define por el plano normal y la dirección de propagación de la luz). En coordenadas cartesianas , el campo eléctrico local es el ángulo de polarización de la luz incidente con respecto al plano de incidencia. La orientación del dipolo de excitación es función de su ángulo con la normal y azimutal con el plano de incidencia. Las dos ecuaciones anteriores para y se pueden combinar para dar la probabilidad de excitar el fluoróforo por unidad de tiempo . Muchos de los parámetros utilizados anteriormente variarían en un experimento normal. La variación en los cinco parámetros siguientes debe incluirse en esta descripción teórica.










  • La coherencia de la luz de excitación.
  • El ángulo de incidencia ( ) de la luz de excitación
  • Ángulo de polarización ( ) de la luz de excitación
  • El ángulo del dipolo de transición ( ) del fluoróforo
  • La longitud de onda de la luz de excitación ( )

La proyección al cuadrado debe promediarse sobre estas cantidades para obtener la probabilidad de excitación . Al promediar los primeros 4 parámetros se obtiene

Ejemplo de un gráfico de intensidad FLIC que muestra la intensidad de fluorescencia relativa medida frente a la distancia del fluoróforo a la superficie reflectante. Es posible que los picos no tengan la misma altura en una parcela experimental real

No se incluyen los factores de normalización. es una distribución del ángulo de orientación de los dipolos fluoróforos. El ángulo azimutal y el ángulo de polarización se integran analíticamente, por lo que ya no aparecen en la ecuación anterior. Para obtener finalmente la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, la ecuación anterior se integra sobre la extensión en la longitud de onda de excitación, teniendo en cuenta la intensidad y el coeficiente de extinción del fluoróforo . Los pasos para calcular son equivalentes a los anteriores en el cálculo, excepto que las etiquetas de los parámetros em se reemplazan con ex e in se reemplaza con out . La intensidad de fluorescencia resultante medida es proporcional al producto de la probabilidad de excitación y la probabilidad de emisión.




Es importante señalar que esta teoría determina una relación de proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia medida y la distancia del fluoróforo por encima de la superficie reflectante. El hecho de que no sea una relación de igualdad tendrá un efecto significativo en el procedimiento experimental.

Configuración experimental

Una oblea de silicio se usa típicamente como superficie reflectante en un experimento FLIC. A continuación, se hace crecer térmicamente una capa de óxido sobre la oblea de silicio para que actúe como espaciador. Sobre el óxido se coloca la muestra marcada con fluorescencia, como una membrana lipídica, una célula o proteínas unidas a la membrana. Con el sistema de muestras construido, todo lo que se necesita es un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD para realizar mediciones cuantitativas de intensidad.

Este es un diagrama de un ejemplo de configuración experimental de FLIC con silicio, tres capas de óxido y una bicapa de lípidos marcada con fluorescencia (las estrellas amarillas representan fluoróforos.

El espesor del dióxido de silicio es muy importante para realizar mediciones FLIC precisas. Como se mencionó anteriormente, el modelo teórico describe la intensidad de fluorescencia relativa medida frente a la altura del fluoróforo. La posición del fluoróforo no se puede leer simplemente en una sola curva FLIC medida. El procedimiento básico es fabricar la capa de óxido con al menos dos espesores conocidos (la capa se puede realizar con técnicas fotolitográficas y el espesor medido por elipsometría ). Los espesores utilizados dependen de la muestra que se mida. Para una muestra con una altura de fluoróforo en el rango de 10 nm, el espesor de óxido de alrededor de 50 nm sería mejor porque la curva de intensidad FLIC es más empinada aquí y produciría el mayor contraste entre las alturas de fluoróforo. El espesor del óxido por encima de unos pocos cientos de nanómetros podría ser problemático porque la curva comienza a difuminarse por la luz policromática y una variedad de ángulos incidentes. Se compara una relación de intensidades de fluorescencia medidas a diferentes espesores de óxido con la relación predicha para calcular la altura del fluoróforo por encima del óxido ( ). La ecuación anterior se puede resolver numéricamente para encontrar . Las imperfecciones del experimento, como la reflexión imperfecta, la incidencia anormal de la luz y la luz policromática tienden a difuminar las curvas de fluorescencia nítidas. La extensión del ángulo de incidencia se puede controlar mediante la apertura numérica (NA). Sin embargo, dependiendo de la apertura numérica utilizada, el experimento producirá una buena resolución lateral (xy) o una buena resolución vertical (z), pero no ambas. Un NA alto (~ 1.0) proporciona una buena resolución lateral, que es mejor si el objetivo es determinar la topografía de largo alcance. La baja NA (~ 0,001), por otro lado, proporciona una medición precisa de la altura z para determinar la altura de una molécula marcada con fluorescencia en un sistema.

Análisis

Ejemplo de datos experimentales recopilados para una muestra etiquetada con fluorescencia de más de 16 espesores de óxido. Ajustar la curva a los 16 puntos de datos daría la altura de los fluoróforos sobre la superficie del óxido.

El análisis básico implica ajustar los datos de intensidad con el modelo teórico permitiendo que la distancia del fluoróforo sobre la superficie del óxido ( ) sea un parámetro libre. Las curvas FLIC se desplazan hacia la izquierda a medida que aumenta la distancia del fluoróforo por encima del óxido. suele ser el parámetro de interés, pero a menudo se incluyen varios otros parámetros gratuitos para optimizar el ajuste. Normalmente se incluyen un factor de amplitud (a) y un término aditivo constante para el fondo (b). El factor de amplitud escala la intensidad relativa del modelo y el fondo constante desplaza la curva hacia arriba o hacia abajo para tener en cuenta la fluorescencia procedente de áreas desenfocadas, como el lado superior de una celda. Ocasionalmente, se permite que la apertura numérica (NA) del microscopio sea un parámetro libre en la adaptación. Los otros parámetros que entran en la teoría óptica, como los diferentes índices de refracción, los espesores de capa y las longitudes de onda de la luz, se suponen constantes con cierta incertidumbre. Un chip FLIC se puede realizar con terrazas de óxido de 9 o 16 alturas distintas dispuestas en bloques. Después de capturar una imagen de fluorescencia, cada bloque de 9 o 16 terrazas produce una curva FLIC separada que define una única . El promedio se encuentra compilando todos los valores en un histograma. El error estadístico en el cálculo de proviene de dos fuentes: el error en el ajuste de la teoría óptica a los datos y la incertidumbre en el espesor de la capa de óxido. El error sistemático proviene de tres fuentes: la medición del espesor del óxido (generalmente mediante elipsómetro), la medición de la intensidad de la fluorescencia con el CCD y la incertidumbre en los parámetros utilizados en la teoría óptica. Se ha estimado que el error sistemático es .

Referencias

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