Microscopía de plano multifocal - Multifocal plane microscopy
La microscopía multifocal plano (MUM) o microscopía Multiplano o microscopía Multifocus es una forma de luz de microscopía que permite el seguimiento de la dinámica 3D en células vivas con un alto temporal y resolución espacial por imágenes simultáneamente diferentes planos focales dentro de la muestra. En esta metodología, la luz recolectada de la muestra por una lente objetivo corregida al infinito se divide en dos caminos. En cada camino, la luz dividida se enfoca en un detector que se coloca a una distancia calibrada específica de la lente del tubo. De esta manera, cada detector genera imágenes de un plano distinto dentro de la muestra. La primera configuración MUM desarrollada fue capaz de obtener imágenes de dos planos distintos dentro de la muestra. Sin embargo, la configuración se puede modificar para obtener imágenes de más de dos planos dividiendo aún más la luz en cada trayectoria de luz y enfocándola en detectores colocados a distancias calibradas específicas. Posteriormente se ha mejorado para obtener imágenes de hasta cuatro planos distintos. Para obtener imágenes de un mayor número de planos focales, se han desarrollado técnicas más sencillas basadas en la óptica de división de imágenes. Un ejemplo es el uso de un prisma de división de imágenes personalizado, que es capaz de capturar hasta 8 planos focales usando solo dos cámaras. Mejor aún, se pueden usar divisores de haz parciales estándar listos para usar para construir un prisma llamado divisor en z que permite imágenes simultáneas de 9 planos focales individuales usando una sola cámara. Otra técnica llamada microscopía multifocal (MFM) utiliza óptica difractiva de Fourier para obtener imágenes de hasta 25 planos focales.
Introducción
La microscopía de fluorescencia de células vivas representa una herramienta importante en el estudio de los eventos de tráfico. El diseño de microscopio convencional está bien adaptado para obtener imágenes de dinámica celular rápida en dos dimensiones, es decir, en el plano de enfoque. Sin embargo, las células son objetos tridimensionales y las vías de tráfico intracelular no suelen estar limitadas a un plano focal. Si la dinámica no se limita a un plano focal, la tecnología de microscopía de plano único convencional es inadecuada para estudios detallados de dinámica intracelular rápida en tres dimensiones. Los enfoques clásicos basados en cambiar el plano focal a menudo no son efectivos en tales situaciones, ya que los dispositivos de enfoque son relativamente lentos en comparación con muchas de las dinámicas intracelulares. Además, el plano focal con frecuencia puede estar en el lugar equivocado en el momento equivocado, por lo que se pierden aspectos importantes de los eventos dinámicos.
Implementación
MUM se puede implementar en cualquier microscopio óptico estándar . Una implementación de ejemplo en un microscopio Zeiss es la siguiente. Primero se conecta un adaptador de video dual Zeiss al puerto lateral de un microscopio Zeiss Axiovert 200. Luego, se concatenan dos adaptadores de video dual Zeiss conectando cada uno de ellos a los puertos de salida del primer adaptador de video Zeiss. A cada uno de los adaptadores de video concatenados, se conecta una cámara CCD de alta resolución mediante el uso de anillos espaciadores / montura C y un adaptador de acoplamiento de cámara mecanizado a medida. El espacio entre el puerto de salida del adaptador de video y la cámara es diferente para cada cámara, lo que da como resultado que las cámaras obtengan imágenes de planos focales distintos.
Vale la pena mencionar que hay muchas formas de implementar MUM. La implementación mencionada ofrece varias ventajas como flexibilidad, facilidad de instalación y mantenimiento, y capacidad de ajuste para diferentes configuraciones. Además, para una serie de aplicaciones, es importante poder adquirir imágenes en diferentes colores en diferentes tiempos de exposición . Por ejemplo, para visualizar la exocitosis en TIRFM , es necesaria una adquisición muy rápida. Sin embargo, para obtener imágenes de un orgánulo estacionario marcado con fluorescencia en la célula, es necesaria una baja excitación para evitar el fotoblanqueo y, como resultado, la adquisición tiene que ser relativamente lenta. En este sentido, la implementación anterior ofrece una gran flexibilidad, ya que se pueden utilizar diferentes cámaras para adquirir imágenes en diferentes canales.
Imágenes 3D de superresolución y seguimiento de una sola molécula con MUM
Las técnicas de microscopía modernas han generado un interés significativo en el estudio de los procesos celulares a nivel de una sola molécula. Los experimentos de una sola molécula superan los efectos de promediado y, por lo tanto, proporcionan información que no es accesible mediante estudios masivos convencionales. Sin embargo, la localización y seguimiento 3D de moléculas individuales plantea varios desafíos. Además de si se pueden capturar o no imágenes de una sola molécula mientras se somete a una dinámica 3D potencialmente muy compleja, surge la pregunta de si se puede determinar la ubicación 3D de la única molécula y con qué precisión se puede hacer.
Un obstáculo importante para la estimación de la ubicación 3D de alta precisión es la escasa discriminación de profundidad de un microscopio estándar. Incluso con un objetivo de apertura numérica alta , la imagen de una fuente puntual en un microscopio convencional no cambia apreciablemente si la fuente puntual se mueve varios cientos de nanómetros desde su posición de enfoque. Esto hace que sea extraordinariamente difícil determinar la posición axial, es decir, z, de la fuente puntual con un microscopio convencional.
De manera más general, la microscopía cuantitativa de una sola molécula para muestras 3D plantea el mismo problema si la aplicación es microscopía de localización / seguimiento o de superresolución como PALM, STORM, FPALM, dSTORM para aplicaciones 3D, es decir, la determinación de la ubicación de una sola molécula en tres dimensiones. MUM ofrece varias ventajas. En MUM, las imágenes de la fuente puntual se adquieren simultáneamente en diferentes niveles de enfoque. Estas imágenes brindan información adicional que se puede utilizar para restringir la posición z de la fuente puntual. Esta información limitante supera en gran medida el problema de discriminación de profundidad cerca del foco.
La medida de localización 3D proporciona una medida cuantitativa de la precisión con la que se puede determinar la ubicación de la fuente puntual . Un valor numérico pequeño de la medida de localización 3D implica una precisión muy alta en la determinación de la ubicación, mientras que un valor numérico grande de la medida de localización 3D implica una precisión muy baja en la determinación de la ubicación. Para un microscopio convencional cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque, por ejemplo, z0 <= 250 nm, la medida de localización 3D predice una precisión muy pobre en la estimación de la posición z. Por tanto, en un microscopio convencional, es problemático realizar un seguimiento 3D cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque.
Por otro lado, para una configuración MUM de dos planos, la medida de localización 3D predice una precisión consistentemente mejor que un microscopio convencional para un rango de valores z, especialmente cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque. Una implicación inmediata de este resultado es que la ubicación z de la fuente puntual se puede determinar con relativamente el mismo nivel de precisión para un rango de valores z, lo que es favorable para el seguimiento 3D de una sola partícula .
Microscopía de plano multifocal de doble objetivo (dMUM)
En aplicaciones de imágenes de partículas individuales, el número de fotones detectados en la etiqueta fluorescente juega un papel crucial en el análisis cuantitativo de los datos adquiridos. Actualmente, los experimentos de seguimiento de partículas se llevan a cabo normalmente en un microscopio invertido o vertical, en el que una sola lente de objetivo ilumina la muestra y también recoge la señal de fluorescencia de ella. Tenga en cuenta que aunque la emisión de fluorescencia de la muestra se produce en todas las direcciones (es decir, por encima y por debajo de la muestra), el uso de una única lente de objetivo en estas configuraciones de microscopio da como resultado la recogida de luz de un solo lado de la muestra. Incluso si se usa una lente de objetivo de alta apertura numérica, no todos los fotones emitidos en un lado de la muestra se pueden recolectar debido al ángulo de recolección finito de la lente del objetivo. Por tanto, incluso en las mejores condiciones de obtención de imágenes, los microscopios convencionales recogen solo una fracción de los fotones emitidos por la muestra.
Para abordar este problema, se puede usar una configuración de microscopio que use dos lentes de objetivo opuestos, donde uno de los objetivos está en una posición invertida y el otro objetivo está en una posición vertical. Esta configuración se denomina microscopía de plano multifocal de doble objetivo (dMUM).