Iluminación vertical modulada espacialmente - Vertico spatially modulated illumination

Microscopía 3D de súper resolución de doble color con Her2 y Her3 en células de cáncer de mama, colorantes estándar: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM + SMI

La iluminación modulada espacialmente de Vertico ( Vertico-SMI ) es el microscopio de luz más rápido para el análisis 3D de células completas en el rango nanométrico . Se basa en dos tecnologías desarrolladas en 1996, SMI (iluminación modulada espacialmente) y SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral). La resolución óptica efectiva de este nanoscopio óptico ha alcanzado la proximidad de 5 nm en 2D y 40 nm en 3D, superando en gran medida el límite de resolución λ / 2 (aproximadamente 200 nm para luz azul) que se aplica a la microscopía estándar mediante transmisión o reflexión de luz natural. (a diferencia de la iluminación estructurada o la fluorescencia ) según el límite de resolución de Abbe Ese límite (también conocido como límite de Rayleigh ) había sido determinado por Ernst Abbe en 1873 y rige el límite de resolución alcanzable de los microscopios utilizando técnicas convencionales.

El microscopio Vertico-SMI fue desarrollado por un equipo dirigido por Christoph Cremer , emérito de la Universidad de Heidelberg , y se basa en la combinación de técnicas ópticas de luz de microscopía de localización (SPDM, microscopía de distancia de precisión espectral ) e iluminación estructurada (SMI, iluminación modulada espacialmente ).

Desde marzo de 2008, muchos tintes fluorescentes estándar, como los tintes fluorescentes GFP y Alexa, se pueden utilizar con esta microscopía de localización denominada SPDMphymod (fluoróforos modificables físicamente), para la que solo una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la obtención de nano imágenes.

Configuración

SMI significa un tipo especial de iluminación óptica láser (iluminación modulada espacialmente ) y Vertico refleja la disposición vertical del eje del microscopio que hace posible el análisis de células fijas pero también de células vivas con una resolución óptica inferior a 10 nanómetros (1 nanómetro = 1 nm = 1 × 10 −9  m).

Una particularidad de esta tecnología en comparación con técnicas de enfoque como la microscopía 4Pi , son las exposiciones de campo amplio que permiten representar células enteras a nanoescala. Una exposición en 3D de este tipo de una celda completa con un tamaño de objeto típico de 20 µm × 20 µm solo requiere 2 minutos. Las exposiciones de campo amplio significan que todo el objeto se ilumina y detecta simultáneamente.

Iluminación modulada espacialmente

SMI + TIRF del tejido del ojo humano afectado por la degeneración macular

La microscopía SMI es un proceso óptico ligero de la denominada función de dispersión puntual: ingeniería. Estos son procesos que modifican la función de dispersión puntual (PSF) de un microscopio de una manera adecuada para aumentar la resolución óptica, para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz de iluminación, o para extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico.

El microscopio SMI que se está desarrollando en el Instituto Kirchhoff de Física de la Universidad de Heidelberg logra esto de la siguiente manera: La intensidad de iluminación dentro del rango del objeto no es uniforme, a diferencia de los microscopios de fluorescencia de campo amplio convencionales, pero se modula espacialmente de manera precisa por el uso de dos rayos láser interferentes opuestos a lo largo del eje. El principio del campo de ondas modulado espacialmente fue desarrollado en 1993 por Bailey et al. El enfoque de microscopía SMI utilizado en la aplicación de Heidelberg mueve el objeto en pasos de alta precisión a través del campo de ondas, o el campo de ondas en sí mismo se mueve en relación con el objeto por cambio de fase. Esto da como resultado una resolución de distancia y tamaño axial mejorada.

SMI se puede combinar con otras tecnologías de súper resolución, por ejemplo con 3D LIMON o LSI- TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente. Esta técnica SMI permitió adquirir imágenes ópticas de luz de distribuciones de autofluoróforos en las secciones de tejido del ojo humano con una resolución óptica sin precedentes. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647 nm) permite recopilar información espectral sobre la señal de autofluorescencia. Esto se ha utilizado para el tejido del ojo humano afectado por la degeneración macular AMD.

SPDM: microscopía de localización

Microscopía de superresolución de una sola molécula de YFP / SPDMphymod

Una única y diminuta fuente de luz se puede ubicar mucho mejor que la resolución de un microscopio: aunque la luz producirá un punto borroso, se pueden utilizar algoritmos informáticos para calcular con precisión el centro del punto borroso, teniendo en cuenta la función de dispersión del punto. del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este enfoque no funciona cuando hay demasiadas fuentes cercanas entre sí: todas las fuentes se difuminan juntas.

SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral) es una familia de técnicas en microscopía de fluorescencia que resuelve este problema midiendo solo unas pocas fuentes a la vez, de modo que cada fuente esté "ópticamente aislada" de las demás (es decir, separada por más de la resolución del microscopio, típicamente ~ 200-250 nm). Luego, se puede utilizar la técnica anterior (encontrar el centro de cada punto borroso).

Si las moléculas tienen una variedad de espectros diferentes (espectros de absorción y / o espectros de emisión), entonces es posible observar la luz de unas pocas moléculas a la vez utilizando las fuentes de luz y los filtros adecuados. Las moléculas también se pueden distinguir de formas más sutiles basándose en el tiempo de vida fluorescente y otras técnicas.

La resolución estructural alcanzable usando SPDM se puede expresar en términos de la menor distancia medible entre dos en su posición espacial determinada partícula puntiforme de diferentes características espectrales ("resolución topológica"). El modelado ha demostrado que en condiciones adecuadas en cuanto a precisión de localización, densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una " frecuencia espacial " que en términos de la definición clásica equivale a una resolución óptica muy mejorada.

SPDM es un microscopio de localización que logra una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional (aprox. 200-250 nm), representada por la mitad de ancho del máximo principal de la función de imagen puntual efectiva. Aplicando procesos de precisión óptica láser adecuados, se pueden medir la posición y distancias significativamente más pequeñas que la mitad del ancho de la función de dispersión de puntos (convencionalmente 200-250 nm) con precisión nanométrica entre objetivos con diferentes firmas espectrales. Un área de aplicación importante es la investigación del genoma (estudio de la organización funcional del genoma ). Otro campo de aplicación importante es la investigación de la estructura de las membranas.

Uno de los fundamentos más importantes de la microscopía de localización en general es el primer trabajo experimental para la localización de objetos fluorescentes en la nanoescala (3D) en 1996 y la prueba teórica y experimental de una precisión de localización utilizando luz visible en el rango de 1 nm - la base para la microscopía de localización mejor que 1/100 de la longitud de onda.

SPDMphymod: tintes fluorescentes estándar en modo intermitente como GFP

Microscopía de localización de doble color SPDM Microscopía de superresolución / fimod con proteínas de fusión GFP y RFP

Solo en los últimos dos años se han utilizado moléculas en estudios nanoscópicos que emiten la misma frecuencia de luz espectral (pero con diferentes firmas espectrales según las características del destello) pero que pueden encenderse y apagarse por medio de la luz según sea necesario para la precisión espectral. microscopía de distancia. Al combinar muchos miles de imágenes de la misma celda, fue posible utilizar mediciones de precisión óptica láser para registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada. La aplicación de estos nuevos procesos de nanoscopía parecía hasta hace poco muy difícil porque se suponía que solo las moléculas especialmente fabricadas podían encenderse y apagarse de manera adecuada mediante el uso de luz.

En marzo de 2008 , el laboratorio de Christoph Cremer descubrió que esto también era posible para muchos tintes fluorescentes estándar como GFP , tintes Alexa y moléculas de fluoresceína, siempre que se presenten ciertas condiciones fotofísicas. Usando esta tecnología llamada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), una sola longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la obtención de nano imágenes. Por el contrario, otras microscopias de localización necesitan dos longitudes de onda de láser cuando se utilizan moléculas de fluorescencia especiales fotoconmutables / fotoactivables.

El gen GFP se ha introducido y expresado en muchas células procarióticas y eucarióticas y el Premio Nobel de Química 2008 fue otorgado a Martin Chalfie , Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien por su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente. El descubrimiento de que se pueden utilizar estas moléculas fluorescentes estándar amplía la aplicabilidad del método SPMD a numerosos campos de investigación en biofísica , biología celular y medicina .

Colorantes fluorescentes estándar ya utilizados con éxito con la tecnología SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 y fluoresceína.

LIMON: microscopía 3D de súper resolución

LIMON (microscopía de nanoescala de microescopia de luz) se inventó en 2001 en la Universidad de Heidelberg y combina la microscopía de localización y la iluminación modulada espacialmente con la microscopía de súper resolución 3D.

Las imágenes 3D que utilizan Vertico-SMI son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM, por lo que primero se aplica el proceso SMI y luego el SPDM. El proceso SMI determina el centro de las partículas y su propagación en la dirección del eje del microscopio. Mientras que el centro de partículas / moléculas se puede determinar con una precisión de 1-2 nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aprox. 30-40 nm.

Posteriormente, se determina la posición lateral de las partículas / moléculas individuales mediante SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros. En la actualidad, SPDM alcanza 16 cuadros / seg con una resolución efectiva de 10 nm en 2D (plano de objeto); aproximadamente 2000 de estos cuadros se combinan con datos SMI (tiempo de adquisición de aproximadamente 10 segundos) para lograr una imagen tridimensional de la resolución más alta (resolución óptica 3D efectiva de aproximadamente 40-50 nm). Con una cámara más rápida , se pueden esperar velocidades aún más altas (hasta varios cientos de fotogramas / seg, en desarrollo). Usando tintes adecuados, deberían ser posibles resoluciones 3D ópticas aún más efectivas

Combinando SPDMphymod con SMI (ambos inventados en el laboratorio de Christoph Cremer en 1996) se logró una reconstrucción de dos colores en 3D de los arreglos espaciales de los clústeres Her2 / neu y Her3. Las posiciones en las tres direcciones de los grupos de proteínas se pudieron determinar con una precisión de aproximadamente 25 nm.

Uso de microscopía de súper resolución en la industria

A pesar de su uso en laboratorios biomédicos, las tecnologías de superresolución podrían servir como herramientas importantes en la investigación farmacéutica. Podrían ser especialmente útiles en la identificación y valoración de objetivos. Por ejemplo, las máquinas biomoleculares (BMM) son nanoestructuras muy complejas que constan de varias moléculas grandes y que son responsables de funciones básicas en las células del cuerpo. Dependiendo de su estado funcional, tienen una estructura 3D definida. Ejemplos de máquinas biomoleculares son los nucleosomas que permiten que el ADN, un portador de información genética de dos metros de largo, se pliegue en las células del cuerpo en un espacio de unas pocas millonésimas de milímetro de diámetro. Por tanto, el ADN puede servir como centro de información y control.

Al utilizar LIMON 3D en combinación con el marcaje del complejo LIMON, es posible por primera vez hacer visibles proteínas o ácidos nucleicos ocultos de un complejo de moléculas 3D de las llamadas máquinas biomoleculares sin destruir el complejo. Hasta ahora, el problema en la mayoría de los casos era que el complejo tenía que ser destruido para un análisis detallado de las macromoléculas individuales que contenía. Alternativamente, se utilizaron modelos virtuales de simulación por computadora o costosos métodos de resonancia magnética nuclear para visualizar la estructura tridimensional de tales complejos.

Literatura

enlaces externos