Microscopía de contraste de interferencia diferencial - Differential interference contrast microscopy
La microscopía de contraste de interferencia diferencial ( DIC ) , también conocida como contraste de interferencia de Nomarski ( NIC ) o microscopía de Nomarski , es una técnica de microscopía óptica utilizada para mejorar el contraste en muestras transparentes sin teñir . DIC funciona según el principio de interferometría para obtener información sobre la longitud del camino óptico de la muestra, para ver características que de otro modo serían invisibles. Un sistema óptico relativamente complejo produce una imagen en la que el objeto aparece de negro a blanco sobre un fondo gris. Esta imagen es similar a la obtenida por microscopía de contraste de fase pero sin el halo de difracción brillante. La técnica fue desarrollada por el físico polaco Georges Nomarski en 1952.
DIC funciona separando una fuente de luz polarizada en dos partes mutuamente coherentes polarizadas ortogonalmente que se desplazan espacialmente (se cortan) en el plano de la muestra y se recombinan antes de la observación. La interferencia de las dos partes en la recombinación es sensible a la diferencia de su camino óptico (es decir, el producto del índice de refracción y la longitud del camino geométrico). Añadiendo una fase de desplazamiento ajustable que determina la interferencia a una diferencia de trayectoria óptica cero en la muestra, el contraste es proporcional al gradiente de la longitud de la trayectoria a lo largo de la dirección de corte, dando la apariencia de un relieve físico tridimensional correspondiente a la variación de densidad óptica de la muestra, enfatizando líneas y bordes aunque no proporcionando una imagen topográficamente precisa.
El camino de la luz
1. La luz no polarizada entra en el microscopio y se polariza a 45 °.
- Se requiere luz polarizada para que la técnica funcione.
2. La luz polarizada entra en el primer prisma Wollaston modificado por Nomarski y se separa en dos rayos polarizados a 90 ° entre sí, los rayos de muestreo y de referencia.
- Los prismas de Wollaston son un tipo de prisma formado por dos capas de una sustancia cristalina, como el cuarzo, que debido a la variación del índice de refracción en función de la polarización de la luz, divide la luz según su polarización. El prisma Nomarski hace que los dos rayos lleguen a un punto focal fuera del cuerpo del prisma y, por lo tanto, permite una mayor flexibilidad al configurar el microscopio, ya que el prisma puede enfocarse activamente.
3. El condensador enfoca los dos rayos para que pasen a través de la muestra. Estos dos rayos están enfocados para que pasen a través de dos puntos adyacentes en la muestra, separados alrededor de 0,2 μm.
- La muestra está efectivamente iluminada por dos fuentes de luz coherentes , una con polarización de 0 ° y la otra con polarización de 90 °. Sin embargo, estas dos iluminaciones no están del todo alineadas, una de ellas está ligeramente desplazada con respecto a la otra.
4. Los rayos viajan a través de áreas adyacentes de la muestra, separadas por el cizallamiento. La separación es normalmente similar a la resolución del microscopio. Experimentarán diferentes longitudes de trayectoria óptica donde las áreas difieren en índice de refracción o espesor. Esto provoca un cambio en la fase de un rayo con respecto al otro debido al retraso experimentado por la onda en el material más denso ópticamente.
- El paso de muchos pares de rayos a través de pares de puntos adyacentes en la muestra (y su absorbancia, refracción y dispersión por la muestra) significa que una imagen de la muestra ahora será transportada por la luz polarizada de 0 ° y 90 °. Estos, si se miran individualmente, serían imágenes de campo brillante de la muestra, ligeramente desplazadas entre sí. La luz también transporta información sobre la imagen invisible para el ojo humano, la fase de la luz. Esto es vital más adelante. Las diferentes polarizaciones evitan la interferencia entre estas dos imágenes en este punto.
5. Los rayos viajan a través de la lente del objetivo y se enfocan para el segundo prisma Wollaston modificado por Nomarski.
6. El segundo prisma recombina los dos rayos en uno polarizado a 135 °. La combinación de los rayos provoca interferencias , aclarando u oscureciendo la imagen en ese punto de acuerdo con la diferencia de trayectoria óptica.
- Este prisma se superpone a las dos imágenes de campo brillante y alinea sus polarizaciones para que puedan interferir. Sin embargo, las imágenes no se alinean del todo debido al desplazamiento en la iluminación; esto significa que en lugar de que se produzca una interferencia entre 2 rayos de luz que pasaron por el mismo punto en la muestra, se produce una interferencia entre los rayos de luz que atravesaron puntos adyacentes que por lo tanto, tienen una fase ligeramente diferente. Debido a que la diferencia de fase se debe a la diferencia en la longitud del camino óptico, esta recombinación de luz provoca una " diferenciación óptica " de la longitud del camino óptico, generando la imagen vista.
Imagen
La imagen tiene la apariencia de un objeto tridimensional bajo una iluminación muy oblicua, provocando fuertes sombras claras y oscuras en las caras correspondientes. La dirección de la iluminación aparente está definida por la orientación de los prismas de Wollaston.
Como se explicó anteriormente, la imagen se genera a partir de dos imágenes de campo brillante idénticas superpuestas ligeramente desplazadas entre sí (típicamente alrededor de 0,2 μm), y la interferencia subsiguiente debido a la diferencia de fase convierte los cambios en la fase (y por lo tanto en la longitud del camino óptico) en un visible cambio en la oscuridad. Esta interferencia puede ser constructiva o destructiva, dando lugar a la apariencia característica de tres dimensiones.
La diferencia de fase típica que da lugar a la interferencia es muy pequeña, y muy raramente supera los 90 ° (un cuarto de la longitud de onda). Esto se debe a la similitud del índice de refracción de la mayoría de las muestras y el medio en el que se encuentran: por ejemplo, una celda en el agua solo tiene una diferencia de índice de refracción de alrededor de 0,05. Esta pequeña diferencia de fase es importante para el funcionamiento correcto de DIC, ya que si la diferencia de fase en la unión entre dos sustancias es demasiado grande, la diferencia de fase podría alcanzar 180 ° (media longitud de onda), lo que resultaría en una interferencia destructiva completa y una oscuridad anómala. región; si la diferencia de fase alcanzara los 360 ° (una longitud de onda completa), produciría una interferencia constructiva completa, creando una región brillante anómala.
La imagen se puede aproximar (despreciando la refracción y la absorción debidas a la muestra y el límite de resolución de la separación del haz) como el diferencial de la longitud del camino óptico con respecto a la posición a lo largo de la muestra a lo largo de la cizalla, y por lo tanto el diferencial del índice de refracción densidad) de la muestra.
El contraste se puede ajustar utilizando la fase de compensación, ya sea traduciendo el prisma objetivo Nomarski o mediante una placa de onda lambda / 4 entre el polarizador y el prisma Normarski del condensador (compensación De-Senarmont). El contraste resultante va desde el campo oscuro para el desplazamiento de fase cero (intensidad proporcional al cuadrado del diferencial de cizallamiento), al relieve típico visto para la fase de ~ 5-90 grados, a la tinción óptica a 360 grados, donde la longitud de onda extinguida cambia con el diferencial de fase.
Cuando se cotejan imágenes desplazadas secuencialmente, el desplazamiento de fase introducido por el objeto puede desacoplarse de los artefactos no interferométricos no deseados, lo que normalmente da como resultado una mejora en el contraste, especialmente en muestras turbias.
Aplicaciones
La DIC se utiliza para obtener imágenes de muestras biológicas vivas y no teñidas, como un frotis de un cultivo de tejidos o de organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Su resolución y claridad en condiciones como ésta no tienen rival entre las técnicas estándar de microscopía óptica.
Un área no biológica en la que se utiliza DIC es en el análisis del procesamiento de semiconductores de silicio plano. Las películas delgadas (típicamente de 100 a 1000 nm) en el procesamiento de silicio son a menudo transparentes a la luz visible (p. Ej., Dióxido de silicio, nitruro de silicio y silicio policristalino), y los defectos en ellas o la contaminación que se encuentra encima de ellas se vuelven más visibles. Esto también permite determinar si una característica es un hoyo en el material del sustrato o una mancha de material extraño en la parte superior. Las características cristalinas grabadas adquieren una apariencia particularmente llamativa bajo DIC.
La calidad de la imagen, cuando se utiliza en condiciones adecuadas, tiene una resolución sobresaliente y está casi completamente libre de artefactos a diferencia del contraste de fase. Sin embargo, el análisis de imágenes DIC siempre debe tener en cuenta la orientación de los prismas de Wollaston y la dirección de iluminación aparente, ya que las características paralelas a esto no serán visibles. Sin embargo, esto se supera fácilmente simplemente girando la muestra y observando los cambios en la imagen.
Ver también
Referencias
- Murphy, D., Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de contraste de modulación, en Fundamentals of Light Microscopy and Digital Imaging, Wiley-Liss, Nueva York, págs. 153-168 (2001).
- Salmon, E. y Tran, P., Microscopio óptico de contraste de interferencia diferencial mejorado por video de alta resolución (VE-DIC)., Microscopía de video, Sluder, G. y Wolf, D. (eds), Academic Press, Nueva York, págs. 153-184 (1998).
- Contraste de interferencia diferencial - referencias
enlaces externos
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