Iluminación Köhler - Köhler illumination
La iluminación de Köhler es un método de iluminación de muestras que se utiliza para microscopía óptica de luz transmitida y reflejada (trans y epiiluminada) . La iluminación de Köhler actúa para generar una iluminación uniforme de la muestra y asegura que una imagen de la fuente de iluminación (por ejemplo, un filamento de lámpara halógena ) no sea visible en la imagen resultante. La iluminación de Köhler es la técnica predominante para la iluminación de muestras en la microscopía de luz científica moderna. Requiere elementos ópticos adicionales que son más caros y pueden no estar presentes en microscopios ópticos más básicos.
Historia y motivación
Antes de la iluminación de Köhler, la iluminación crítica era la técnica predominante para la iluminación de muestras. La iluminación crítica tiene la principal limitación de que la imagen de la fuente de luz (típicamente una bombilla ) cae en el mismo plano que la imagen de la muestra, es decir, el filamento de la bombilla es visible en la imagen final. La imagen de la fuente de luz a menudo se denomina imagen de filamento . Por tanto, la iluminación crítica proporciona una iluminación desigual de la muestra; las regiones brillantes en la imagen del filamento iluminan esas regiones de la muestra con más intensidad. La iluminación desigual no es deseable ya que puede introducir artefactos como deslumbramiento y sombras en la imagen.
Se pueden usar varios métodos para difundir la imagen del filamento, incluida la reducción de potencia a la fuente de luz o el uso de una bombilla de vidrio opalino o un difusor de vidrio opal entre la bombilla y la muestra. Todos estos métodos son, hasta cierto punto, funcionales para reducir la irregularidad de la iluminación, sin embargo, todos reducen la intensidad de la iluminación y alteran el rango de longitudes de onda de la luz que llegan a la muestra.
Para abordar estas limitaciones, August Köhler diseñó un método de iluminación que utiliza una imagen perfectamente desenfocada de la fuente de luz para iluminar la muestra. Este trabajo fue publicado en 1893 en el Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie y pronto fue seguido por la publicación de una traducción al inglés en el Journal of the Royal Microscopical Society .
La iluminación de Köhler también se ha desarrollado en el contexto de la óptica sin imágenes .
Principios ópticos
La principal limitación de la iluminación crítica es la formación de una imagen de la fuente de luz en el plano de la imagen de la muestra. La iluminación de Köhler aborda este problema asegurando que la imagen de la fuente de luz esté perfectamente desenfocada en el plano de la muestra y sus planos de imagen conjugados . En un diagrama de rayos de la trayectoria de la luz de iluminación, esto puede verse como los rayos formadores de imágenes que pasan paralelos a través de la muestra.
La iluminación de Köhler requiere varios componentes ópticos para funcionar:
- Lente colectora y / o lente de campo
- Diafragma de campo
- Diafragma de condensador
- Lentes condensadores
Estos componentes se encuentran en este orden entre la fuente de luz y la muestra y controlan la iluminación de la muestra. Las lentes de campo / colector actúan para recoger la luz de la fuente de luz y enfocarla en el plano del diafragma del condensador. La lente del condensador actúa para proyectar esta luz, sin enfocarla, a través de la muestra. Este esquema de iluminación crea dos conjuntos de planos de imagen conjugados, uno con la imagen de la fuente de luz y otro con la muestra. Estos dos conjuntos de planos de imagen se encuentran en los siguientes puntos (consulte la imagen para ver números y letras):
- Planos de imagen de la fuente de luz (etiquetados con una barra de color verde claro en la imagen):
- Filamento de lámpara (1)
- Membrana de condensador (2)
- Plano focal posterior del objetivo (3)
- El punto de vista (4)
- Planos de imagen de muestra:
- Diafragma de campo (A)
- Espécimen (B)
- Plano de imagen intermedio (el diafragma del ocular) (C)
- La retina del ojo o el sensor de la cámara (D)
Ventajas
La principal ventaja de la iluminación de Köhler es la iluminación uniforme de la muestra. Esto reduce los artefactos de la imagen y proporciona un alto contraste de muestra. La iluminación uniforme de la muestra también es fundamental para las técnicas de iluminación avanzadas, como el contraste de fase y la microscopía de contraste de interferencia diferencial .
El ajuste del diafragma del condensador altera el contraste de la muestra . Además, alterar el tamaño del diafragma del condensador permite ajustar la profundidad de campo de la muestra al alterar la apertura numérica efectiva del microscopio. La función del diafragma condensador es análoga a la apertura en la fotografía, aunque el diafragma condensador de un microscopio funciona controlando la iluminación de la muestra, mientras que la apertura de una cámara funciona controlando la iluminación del detector.
La alteración del diafragma del condensador permite que la cantidad de luz que ingresa a la muestra se ajuste libremente sin alterar las longitudes de onda de la luz presente, en contraste con la reducción de potencia a la fuente de luz con iluminación crítica (que cambia la temperatura de color de la lámpara). Este ajuste siempre está acoplado a una alteración de la apertura numérica del sistema, como se indicó anteriormente, por lo que todavía es necesario el ajuste de la intensidad de la fuente de iluminación por otros medios.
Mediante el ajuste del diafragma de campo, la imagen de la apertura del diafragma de campo en el plano de la muestra se establece en un tamaño ligeramente mayor que la región de la imagen de la muestra (que corresponde a su vez a la parte de la imagen de muestra arrojada al ocular ). ). Dado que el diafragma de campo, la muestra y la parada del campo del ocular se encuentran en planos de imagen conjugados , este ajuste permite que los rayos iluminadores llenen completamente el campo de visión del ocular, al tiempo que minimiza la cantidad de luz extraña que debe ser bloqueada por la parada del campo del ocular. Esta luz extraña se dispersa dentro del sistema y degrada el contraste.
Prueba y configuración de la iluminación Köhler
Los microscopios que utilizan iluminación de Köhler deben comprobarse de forma rutinaria para comprobar que están alineados correctamente. El procedimiento de realineación prueba si los componentes ópticos correctos están enfocados en los dos conjuntos de planos de imagen conjugados; los planos de imagen de la fuente de luz y los planos de imagen de la muestra.
La alineación de los componentes ópticos en el plano de la imagen de la muestra se realiza típicamente cargando primero una muestra de prueba y enfocándola moviendo el objetivo o la muestra. Luego, el diafragma de campo se cierra parcialmente; los bordes del diafragma deben estar en los mismos planos de imagen conjugada que la muestra, por lo tanto, deben aparecer enfocados. El enfoque se puede ajustar subiendo o bajando las lentes del condensador y el diafragma. Finalmente, el diafragma de campo se vuelve a abrir un poco más allá del campo de visión.
Para probar la alineación de los componentes en el plano de la imagen de la fuente de luz, el ocular debe retirarse para permitir la observación del plano de imagen intermedio (la posición del diafragma del ocular) ya sea directamente o utilizando un telescopio de fase / lente Bertrand . La fuente de luz (por ejemplo, el filamento de la bombilla) y los bordes del diafragma del condensador deben aparecer enfocados. Cualquier componente óptico en el plano focal posterior del objetivo (por ejemplo, el anillo de fase para microscopía de contraste de fase) y en el diafragma de condensador (por ejemplo, el anillo para microscopía de contraste de fase) también debería aparecer enfocado.
Ver también
- Integración de Köhler
- Filtrado espacial , el principio óptico implementado en el diafragma de campo del iluminador Köhler
- Microscopía de luz polarizada
- Microscopía de contraste de modulación Hoffman
Referencias
- ↑ Köhler, agosto (1893). "Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke" . Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für Mikroskopische Technik . 10 (4): 433–440.
- ^ Koehler, agosto (1894). "Nuevo método de iluminación con fines fotomicrográficos" . Revista de la Royal Microscopical Society . 14 : 261-262.
- ^ Chaves, Julio (2015). Introducción a la óptica sin imágenes, segunda edición . Prensa CRC . ISBN 978-1482206739 .