Microdisección por captura láser - Laser capture microdissection
La microdisección por captura con láser ( LCM ), también llamada microdisección , microdisección con láser ( LMD ) o microdisección asistida por láser ( LMD o LAM ), es un método para aislar células específicas de interés de regiones microscópicas de tejido / células / organismos ( disección en un escala microscópica con la ayuda de un láser ).
Principio
La microdisección por captura de láser (LCM) es un método para obtener subpoblaciones de células de tejido bajo visualización microscópica directa. La tecnología LCM puede recolectar las células de interés directamente o puede aislar células específicas cortando las células no deseadas para dar poblaciones de células enriquecidas histológicamente puras. Existe una variedad de aplicaciones posteriores: análisis de genotipado de ADN y pérdida de heterocigosidad (LOH), perfil de transcripción de ARN , generación de bibliotecas de ADNc , descubrimiento de proteómica y perfil de vía de señal. El tiempo total necesario para llevar a cabo este protocolo suele ser de 1 a 1,5 h.
Extracción
Se acopla un láser a un microscopio y se enfoca en el tejido del portaobjetos. Mediante el movimiento del láser por la óptica o el escenario, el foco sigue una trayectoria predefinida por el usuario. Esta trayectoria, también llamada elemento , se corta y se separa del tejido adyacente. Después del proceso de corte, debe seguir un proceso de extracción si se desea un proceso de extracción. Las tecnologías más recientes utilizan microdisección sin contacto.
Hay varias formas de extraer tejido de un portaobjetos de microscopio con una muestra de histopatología . Presione una superficie pegajosa sobre la muestra y sáquela. Esto extrae la región deseada, pero también puede eliminar partículas o tejido no deseado en la superficie, porque la superficie no es selectiva. Derretir una membrana de plástico sobre la muestra y arrancar. El calor se introduce, por ejemplo, mediante un láser rojo o infrarrojo (IR) sobre una membrana teñida con un tinte absorbente. A medida que se adhiere la muestra deseada a la membrana, al igual que con cualquier membrana que se coloca cerca de la superficie de la muestra de histopatología, es posible que se extraigan algunos residuos. Otro peligro es el calor introducido: algunas moléculas como el ADN, el ARN o las proteínas no permiten que se calienten demasiado o en absoluto con el objetivo de aislarlas de la manera más pura posible.
Para transporte sin contacto. Hay tres enfoques diferentes. Transporte por gravedad utilizando un microscopio vertical (llamado GAM, microdisección asistida por gravedad ) o transporte por catapulta de presión láser ; la generación más reciente utiliza una tecnología basada en la transferencia directa inducida por láser (LIFT). Con el corte y captura, se coloca una tapa recubierta con un adhesivo directamente sobre la sección de tejido finamente cortada (5-8 μm), la sección en sí descansa sobre una membrana delgada (polietileno naftaleno). Un láser IR calienta suavemente el adhesivo de la tapa fusionándolo con el tejido subyacente y un láser UV corta el tejido y la membrana subyacente. La entidad de tejido de membrana ahora se adhiere a la tapa y las células de la tapa se pueden usar en aplicaciones posteriores (ADN, ARN, análisis de proteínas).
Procedimiento
Bajo un microscopio utilizando una interfaz de software, se observa una sección de tejido (normalmente de 5 a 50 micrómetros de espesor) y se identifican células individuales o grupos de células, ya sea de forma manual o semiautomatizada o más completamente automatizada, lo que permite la obtención de imágenes y luego la selección automática de objetivos de aislamiento. Actualmente existen seis tecnologías primarias de aislamiento / recolección que utilizan un microscopio y un dispositivo para el aislamiento celular. Cuatro de estos utilizan típicamente un láser pulsado ultravioleta (355 nm) para cortar los tejidos directamente o las membranas / película, y a veces en combinación con un láser IR responsable de calentar / fundir un polímero pegajoso para la adhesión y el aislamiento celular. El láser IR proporciona un enfoque más suave para la microdisección. Una quinta tecnología basada en láser ultravioleta utiliza portaobjetos especiales recubiertos con un recubrimiento de transferencia de energía que, cuando se activa mediante el pulso del láser, impulsa el tejido o las células hacia una tapa de recolección.
El ancho de corte del láser suele ser inferior a 1 μm, por lo que las células objetivo no se ven afectadas por el rayo láser. Incluso las células vivas no son dañadas por el corte por láser y son viables después del corte para clonación y recultivo según corresponda.
Las diversas tecnologías se diferencian en el proceso de recolección, los posibles métodos de imagen ( microscopía de fluorescencia / microscopía de campo brillante / diferencial microscopía de contraste de interferencia / microscopía de contraste de fase / etc.) y los tipos de los titulares y preparación de tejido necesarios antes de la formación de imágenes y el aislamiento. La mayoría son principalmente sistemas de micro-disección dedicados, y algunos también se pueden usar como microscopios de investigación, solo una tecnología (# 2 aquí, Leica) usa un microscopio vertical, lo que limita un poco algunas de las capacidades de manejo de muestras, especialmente para el trabajo con células vivas.
La primera tecnología (utilizada por Carl Zeiss PALM) corta alrededor de la muestra y luego la recolecta mediante una tecnología de "catapulta". La muestra puede ser catapultada desde un portaobjetos o placa de cultivo especial mediante un pulso de láser UV desenfocado que genera una fuerza fotónica para impulsar el material fuera del portaobjetos / placa, una técnica a veces llamada catapultado a presión por micro-disección láser (LMPC). El material disecado se envía hacia arriba (hasta varios milímetros) a una tapa de tubo de microcentrífuga u otro colector que contenga un tampón o un material pegajoso especializado en la tapa del tubo al que se adherirá el tejido. Este proceso de catapulta activo evita algunos de los problemas estáticos cuando se utilizan portaobjetos recubiertos de membrana.
Otro proceso sigue el método de microdisección asistido por gravedad que activa la gravedad para recolectar muestras en la tapa del tubo debajo del portaobjetos utilizado (utilizado por el sistema ION LMD , Jungwoo F&B). En el caso de este sistema, mueve la platina motorizada para cortar las células de interés, manteniendo fijo el rayo láser. Y el sistema utiliza un láser de estado sólido ( UV-A ) de 355 nm, que es la forma más segura de cortar los tejidos sin dañar el ARN o el ADN.
Otro proceso LCM estrechamente relacionado (utilizado por Leica) corta la muestra desde arriba y la muestra cae por gravedad (microdisección asistida por gravedad) en un dispositivo de captura debajo de la muestra. El punto diferente con el superior es que el rayo láser aquí se mueve para cortar tejido moviendo un espejo dicroico.
Cuando las células (en un portaobjetos o placa de cultivo especial) de elección se encuentran en el centro del campo de visión, el operador selecciona las células de interés utilizando el software del instrumento. El área que se aislará cuando se coloque un láser de infrarrojo cercano para activar la película de transferencia en una tapa sobre la muestra de tejido, derritiendo el adhesivo que luego fusiona la película con las células subyacentes de su elección (consulte los sistemas Arcturus); y / o activando un láser UV para cortar la célula de interés. Luego, las células se extraen de la sección delgada de tejido, dejando atrás todas las células no deseadas. Luego, las células de interés se visualizan y documentan antes de la extracción.
La cuarta tecnología basada en UV (utilizada por Molecular Machines and Industries AG) ofrece una ligera diferencia con la tercera tecnología aquí al crear esencialmente una especie de sándwich con diapositiva> muestra> y membrana que recubre la muestra mediante el uso de un marco deslizante cuya superficie de membrana es cortado por el láser y finalmente recogido desde arriba por una tapa adhesiva especial.
Una quinta tecnología basada en UV utiliza portaobjetos de vidrio estándar recubiertos con un revestimiento de transferencia de energía inerte y un sistema de microdisección láser basado en UV (normalmente una máquina Leica LMD o PALM Zeiss). Las secciones de tejido se montan encima del revestimiento de transferencia de energía. La energía de un láser UV se convierte en energía cinética al golpear el revestimiento, vaporizándolo e impulsando instantáneamente las características del tejido seleccionado al tubo colector. Los portaobjetos recubiertos de transferencia de energía, comercializados con el nombre comercial de portaobjetos DIRECTOR por Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), ofrecen varias ventajas para el trabajo proteómico. Tampoco son autofluorescentes, por lo que se pueden utilizar para aplicaciones con tintes fluorescentes, DIC o luz polarizada.
Además de las secciones de tejido, la LCM se puede realizar en células / organismos vivos, frotis de células, preparaciones de cromosomas y tejido vegetal.
Aplicaciones
El proceso de microdisección por captura láser no altera ni daña la morfología y la química de la muestra recolectada, ni las células circundantes. Por esta razón, LCM es un método útil para recolectar células seleccionadas para análisis de ADN , ARN y / o proteínas . La LCM también se ha utilizado para aislar estructuras acelulares, como placas amiloides . La LCM se puede realizar en una variedad de muestras de tejido , incluidos frotis de sangre , preparaciones citológicas, cultivos celulares y alícuotas de tejido sólido. También se puede utilizar tejido de archivo congelado e incluido en parafina.
Referencias
enlaces externos
- Universidad de Carolina del Este: LCM para "tontos"
- Proyecto Atlas transcripcional de arroz de Yale que emplea microdisección por captura láser