nucleasa -Nuclease
Una nucleasa (también conocida arcaicamente como nucleodepolimerasa o polinucleotidasa ) es una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos de los ácidos nucleicos . Las nucleasas efectúan diversas roturas de cadena sencilla y doble en sus moléculas diana. En los organismos vivos, son maquinaria esencial para muchos aspectos de la reparación del ADN . Los defectos en ciertas nucleasas pueden causar inestabilidad genética o inmunodeficiencia . Las nucleasas también se utilizan ampliamente en la clonación molecular .
Hay dos clasificaciones principales basadas en el lugar de actividad. Las exonucleasas digieren los ácidos nucleicos de los extremos. Las endonucleasas actúan en regiones en el medio de las moléculas diana. Se subcategorizan además como desoxirribonucleasas y ribonucleasas . El primero actúa sobre el ADN , el segundo sobre el ARN .
Historia
A fines de la década de 1960, los científicos Stuart Linn y Werner Arber aislaron ejemplos de los dos tipos de enzimas responsables de la restricción del crecimiento de fagos en la bacteria Escherichia coli ( E. coli ). Una de estas enzimas agregó un grupo metilo al ADN, generando ADN metilado , mientras que la otra escindió el ADN no metilado en una amplia variedad de lugares a lo largo de la longitud de la molécula. El primer tipo de enzima se denominó " metilasa " y el otro " nucleasa de restricción ". Estas herramientas enzimáticas eran importantes para los científicos que estaban reuniendo las herramientas necesarias para " cortar y pegar " moléculas de ADN. Lo que entonces se necesitaba era una herramienta que cortara el ADN en sitios específicos, en lugar de en sitios aleatorios a lo largo de la molécula, para que los científicos pudieran cortar moléculas de ADN de una manera predecible y reproducible.
Un avance importante se produjo cuando HO Smith , KW Wilcox y TJ Kelly , trabajando en la Universidad Johns Hopkins en 1968, aislaron y caracterizaron la primera nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia de nucleótidos de ADN específica. Trabajando con la bacteria Haemophilus influenzae , este grupo aisló una enzima, llamada Hind II , que siempre corta las moléculas de ADN en un punto particular dentro de una secuencia específica de seis pares de bases. Descubrieron que la enzima Hind II siempre corta directamente en el centro de esta secuencia (entre el tercer y el cuarto par de bases).
Sistema de clasificación numérica
La mayoría de las nucleasas están clasificadas por el número de la Comisión de Enzimas del "Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular " como hidrolasas (EC-número 3). Las nucleasas pertenecen al igual que la fosfodiesterasa , la lipasa y la fosfatasa a las esterasas (EC-número 3.1), un subgrupo de las hidrolasas. Las esterasas a las que pertenecen las nucleasas se clasifican con los números CE 3.1.11 - número CE 3.1.31.
Estructura
La estructura primaria de la nucleasa está, en general, mal conservada y mínimamente conservada en los sitios activos, cuyas superficies comprenden principalmente residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Las nucleasas se pueden clasificar en familias plegables.
Reconocimiento del sitio
Una nucleasa debe asociarse con un ácido nucleico antes de que pueda escindir la molécula. Eso implica un grado de reconocimiento. Las nucleasas emplean asociaciones inespecíficas y específicas en sus modos de reconocimiento y unión. Ambos modos juegan un papel importante en los organismos vivos, especialmente en la reparación del ADN.
Las endonucleasas no específicas involucradas en la reparación del ADN pueden escanear el ADN en busca de secuencias objetivo o daños . Tal nucleasa se difunde a lo largo del ADN hasta que encuentra un objetivo, sobre el cual los residuos de su sitio activo interactúan con los grupos químicos del ADN. En el caso de endonucleasas como EcoRV , BamHI y PvuII, esta unión no específica implica interacciones electrostáticas entre el área de superficie mínima de la proteína y el ADN. Esta asociación débil deja la forma general del ADN sin deformar, permaneciendo en forma B.
APor el contrario , la nucleasa específica del sitio forma asociaciones mucho más fuertes. Atrae el ADN hacia el surco profundo de su dominio de unión al ADN . Esto da como resultado una deformación significativa de la estructura terciaria del ADN y se logra con superficies ricas en residuos básicos (cargados positivamente). Participa en una amplia interacción electrostática con el ADN.
Algunas nucleasas implicadas en la reparación del ADN exhiben una especificidad de secuencia parcial. Sin embargo, la mayoría son inespecíficos, en lugar de reconocer anomalías estructurales producidas en la columna vertebral del ADN por desajustes de pares de bases .
Estructura nucleasa específica
Para obtener más información, consulte endonucleasa de colgajo .
Nucleasa específica de secuencia
| Enzima | Fuente | Secuencia de reconocimiento | Cortar |
|---|---|---|---|
| Hind II | Haemophilus influenzae |
5'–GTYRAC–3' |
5'– GTY RAC –3' |
| R = A o G ; Y = C o T | |||
Se han aislado más de 900 enzimas de restricción, algunas de secuencia específica y otras no, de más de 230 cepas de bacterias desde el descubrimiento inicial de Hind II. Estas enzimas de restricción generalmente tienen nombres que reflejan su origen: la primera letra del nombre proviene del género y las dos segundas letras provienen de la especie de la célula procariota de la que se aislaron. Por ejemplo, Eco RI proviene de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que HindII proviene de la cepa Rd de Haemophilus influenzae . Los números que siguen a los nombres de las nucleasas indican el orden en que se aislaron las enzimas de cepas únicas de bacterias: Eco RI , Eco RII .
endonucleasas
Una endonucleasa de restricción funciona "explorando" la longitud de una molécula de ADN. Una vez que encuentra su secuencia de reconocimiento específica particular, se unirá a la molécula de ADN y hará un corte en cada uno de los dos esqueletos de azúcar-fosfato. Las posiciones de estos dos cortes, tanto entre sí como con respecto a la propia secuencia de reconocimiento, están determinadas por la identidad de la endonucleasa de restricción. Diferentes endonucleasas producen diferentes conjuntos de cortes, pero una endonucleasa siempre cortará una secuencia de bases particular de la misma manera, sin importar sobre qué molécula de ADN esté actuando. Una vez realizados los cortes, la molécula de ADN se romperá en fragmentos.
Corte escalonado
No todas las endonucleasas de restricción cortan simétricamente y dejan extremos romos como el Hind II descrito anteriormente. Muchas endonucleasas rompen los esqueletos del ADN en posiciones que no están directamente opuestas entre sí, creando salientes. Por ejemplo, la nucleasa Eco RI tiene la secuencia de reconocimiento 5'—GAATTC—3'.
| Enzima | Fuente | Secuencia de reconocimiento | Cortar |
|---|---|---|---|
| Hind III | Haemophilus influenzae |
5'–AAGCTT–3'
3'–TTCGAA–5' |
5'– A AGCTT –3'
3'– TTCGA A –5' |
| IR ecológica | Escherichia coli |
5'–GAATTC-3'
3'–CTTAAG–5' |
5'– G AATTC –3'
3'– CTTAA G –5' |
| bam hola | Bacilo amyloliquefaciens |
5'–GGATCC–3'
3'–CCTAGG–5' |
5'– G GATCC –3'
3'– CCTAG G –5' |
Cuando la enzima encuentra esta secuencia, escinde cada esqueleto entre los residuos de base G y A más cercanos. Una vez que se han hecho los cortes, los fragmentos resultantes se mantienen unidos solo por los enlaces de hidrógeno relativamente débiles que mantienen las bases complementarias entre sí. La debilidad de estos enlaces permite que los fragmentos de ADN se separen unos de otros. Cada fragmento resultante tiene un extremo 5' que sobresale compuesto de bases desapareadas. Otras enzimas crean cortes en la columna vertebral del ADN que dan como resultado extremos 3' sobresalientes. Los extremos que sobresalen, tanto 3' como 5', a veces se denominan " extremos pegajosos " porque tienden a unirse con secuencias complementarias de bases. En otras palabras, si una longitud de bases no emparejada 5'—AATT—3'se encuentra con otra longitud no emparejada con la secuencia, 3'—TTAA—5'se unirán entre sí, son "pegajosas" entre sí. Luego se usa la enzima ligasa para unir los esqueletos de fosfato de las dos moléculas. El origen celular, o incluso el origen de especie, de los extremos cohesivos no afecta a su pegajosidad. Cualquier par de secuencias complementarias tenderá a unirse, incluso si una de las secuencias proviene de un fragmento de ADN humano y la otra proviene de un fragmento de ADN bacteriano. De hecho, es esta cualidad de pegajosidad la que permite la producción de moléculas de ADN recombinante, moléculas compuestas de ADN de diferentes fuentes, y que ha dado origen a la tecnología de la ingeniería genética .
Papel en la naturaleza
Reparación de ADN
Dado que todas las células dependen del ADN como medio de información genética, el control de la calidad genética es una función esencial de todos los organismos. La replicación del ADN es un proceso propenso a errores, y las propias moléculas de ADN son vulnerables a la modificación por muchos factores estresantes metabólicos y ambientales. Los ejemplos ubicuos incluyen especies reactivas de oxígeno , cerca del ultravioleta y radiación ionizante . Muchas nucleasas participan en la reparación del ADN al reconocer los sitios dañados y separarlos del ADN circundante. Estas enzimas funcionan independientemente o en complejos . La mayoría de las nucleasas involucradas en la reparación del ADN no son específicas de secuencia. Reconocen los sitios dañados a través de la deformación de la estructura secundaria del ADN de doble cadena (dsDNA).
Corrección de replicación
Durante la replicación del ADN , las ADN polimerasas alargan las nuevas hebras de ADN contra las hebras molde complementarias. La mayoría de las ADN polimerasas comprenden dos dominios enzimáticos diferentes : una polimerasa y una exonucleasa correctora . La polimerasa alarga la nueva hebra en la dirección 5' → 3'. La exonucleasa elimina los nucleótidos erróneos de la misma hebra en la dirección 3' → 5'. Esta actividad de exonucleasa es esencial para la capacidad de revisión de una ADN polimerasa. Las deleciones que inactivan o eliminan estas nucleasas aumentan las tasas de mutación y mortalidad en los microbios afectados y el cáncer en ratones.
Bifurcación de replicación detenida
Muchas formas de daño en el ADN detienen la progresión de la horquilla de replicación , lo que hace que las ADN polimerasas y la maquinaria asociada abandonen la horquilla. Luego debe ser procesado por proteínas específicas de horquilla. El más notable es MUS81 . Las deleciones de las cuales causan sensibilidad al daño por UV o metilación en la levadura , además de defectos meióticos.
Procesamiento de fragmentos de Okazaki
Una tarea omnipresente en las células es la eliminación de los cebadores de ARN del fragmento de Okazaki de la replicación. La mayoría de estos cebadores se escinden de la cadena retrasada de ADN recién sintetizada mediante endonucleasas de la familia RNasa H. En eucariotas y en arqueas , la endonucleasa flap FEN1 también participa en el procesamiento de los fragmentos de Okazaki.
Reparación de desajustes
La reparación de errores de emparejamiento de ADN en cualquier organismo dado se efectúa mediante un conjunto de endonucleasas específicas de errores de emparejamiento. En los procariotas, esta función la desempeñan principalmente MutSLH y proteínas asociadas a la reparación de parches muy cortos (reparación VSP).
El sistema MutSLH (que comprende MutS , MutL y MutH) corrige mutaciones puntuales y pequeños giros . MutS reconoce y se une a los desajustes, donde recluta MutL y MutH. MutL media en la interacción entre MutS y MutH y potencia la actividad endonucleasa de este último. MutH reconoce 5'—GATC—3'sitios hemimetilados y escinde junto a la Ghebra no metilada (la hebra sintetizada más recientemente).
La reparación de VSP es iniciada por la endonucleasa Vsr. Corrige un T/Gdesajuste específico causado por la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timinas. Vsr reconoce la secuencia , donde corta la hebra de ADN en el lado 5' de la timina no coincidente (subrayada en la secuencia anterior). Una de las exonucleasas RecJ, ExoVII o ExoI luego degrada el sitio antes de que la ADN polimerasa vuelva a sintetizar el espacio en la hebra.
5'—CTWGG—3'
Reparación de escisión de base
La formación del sitio AP es una ocurrencia común en dsDNA. Es el resultado de la hidrólisis espontánea y de la actividad de las ADN glucosilasas como paso intermedio en la reparación por escisión de bases . Estos sitios AP son eliminados por endonucleasas AP , que provocan roturas de una sola hebra alrededor del sitio.
Reparación por escisión de nucleótidos
La reparación por escisión de nucleótidos , que no debe confundirse con la reparación por escisión de bases, implica la eliminación y el reemplazo de los nucleótidos dañados. Los casos de entrecruzamiento , aductos y lesiones (generados por luz ultravioleta o especies reactivas de oxígeno ) pueden desencadenar esta vía de reparación. Los tramos cortos de ADN monocatenario que contienen dicho nucleótido dañado se eliminan del ADN dúplex mediante endonucleasas separadas que efectúan muescas corriente arriba y corriente abajo del daño. Las deleciones o mutaciones que afectan a estas nucleasas provocan una mayor sensibilidad al daño ultravioleta y la carcinogénesis. Tales anomalías pueden incluso afectar el desarrollo neuronal.
En bacterias, ambos cortes ejecutados por el complejo UvrB-UvrC . En la levadura en ciernes, Rad2 y el complejo Rad1-Rad10 hacen los cortes de 5' y 3', respectivamente. En los mamíferos, los homólogos XPG y XPF - ERCC1 afectan a las mismas muescas respectivas.
Reparación de rotura de doble hebra
Las roturas de doble cadena , tanto intencionales como no intencionales, ocurren regularmente en las células. Las interrupciones no intencionales se generan comúnmente por radiación ionizante , varios agentes químicos exógenos y endógenos y horquillas de replicación detenidas. Las rupturas intencionales se generan como intermediarios en la meiosis y la recombinación V(D)J , que se reparan principalmente a través de la recombinación homóloga y la unión de extremos no homólogos . Ambos casos requieren que los extremos de las roturas de doble cadena sean procesados por nucleasas antes de que pueda llevarse a cabo la reparación. Una de estas nucleasas es Mre11 complejada con Rad50 . Las mutaciones de Mre11 pueden precipitar un trastorno similar a la ataxia-telangiectasia .
La recombinación V(D)J implica la apertura de estructuras de bucles de tallo asociadas con roturas de doble cadena y, posteriormente, la unión de ambos extremos. El complejo Artemis-DNAPK cs participa en esta reacción. Aunque Artemis exhibe actividad exonucleasa 5' → 3' ssDNA cuando está sola, su formación de complejos con DNA-PK cs permite el procesamiento endonucleaso de los bucles de tallo. Los defectos de cualquiera de las dos proteínas confieren una inmunodeficiencia grave.
La recombinación homóloga, por otro lado, implica dos dúplex de ADN homólogos conectados por bucles D o uniones de Holliday . En las bacterias, las endonucleasas como RuvC resuelven las uniones de Holliday en dos dsDNA separados al dividir las uniones en dos sitios simétricos cerca del centro de unión. En eucariotas, FEN1 , XPF - ERCC1 y MUS81 escinden los bucles D, y Cce1 / Ydc2 procesa las uniones de Holliday en las mitocondrias.
meganucleasas
La frecuencia a la que una nucleasa en particular cortará una molécula de ADN determinada depende de la complejidad del ADN y de la longitud de la secuencia de reconocimiento de la nucleasa; debido a la probabilidad estadística de encontrar las bases en un orden particular por casualidad, una secuencia de reconocimiento más larga resultará en una digestión menos frecuente. Por ejemplo, se predice que una secuencia de cuatro bases dada (correspondiente al sitio de reconocimiento de una nucleasa hipotética) ocurrirá cada 256 pares de bases en promedio (donde 4^4=256), pero se esperaría cualquier secuencia de seis bases dada ocurrir una vez cada 4096 pares de bases en promedio (4^6=4096).
Una familia única de nucleasas son las meganucleasas , que se caracterizan por tener secuencias de reconocimiento más grandes y, por lo tanto, menos comunes que consisten en 12 a 40 pares de bases. Estas nucleasas son particularmente útiles para la ingeniería genética y las aplicaciones de ingeniería del genoma en organismos complejos como plantas y mamíferos, donde los genomas típicamente más grandes (con miles de millones de pares de bases) darían como resultado una digestión específica del sitio frecuente y perjudicial utilizando nucleasas tradicionales.
Ver también
- HindIII
- ligasa
- Nucleasa microcócica
- Ensayo de protección de nucleasa
- nucleasa P1
- PIN de dominio
- polimerasa
- nucleasa S1
