Ensayo - Assay

Un ensayo es un procedimiento de investigación (analítico) en medicina de laboratorio , minería , farmacología , biología ambiental y biología molecular para evaluar cualitativamente o medir cuantitativamente la presencia, cantidad o actividad funcional de una entidad objetivo. El analito puede ser un fármaco , una sustancia bioquímica , un elemento o compuesto químico , o una célula en un organismo o muestra orgánica . La entidad medida a menudo se denomina analito , mensurando o objetivo del ensayo. Un ensayo generalmente tiene como objetivo medir la propiedad intensiva de un analito y expresarla en la unidad de medida relevante (por ejemplo , molaridad , densidad , actividad funcional en unidades internacionales de enzimas, grado de efecto en comparación con un estándar, etc.).

Si el ensayo involucra reactivos exógenos (los reactivos ), entonces sus cantidades se mantienen fijas (o en exceso) de modo que la cantidad y la calidad del objetivo sean los únicos factores limitantes. La diferencia en el resultado del ensayo se utiliza para deducir la calidad o cantidad desconocida del objetivo en cuestión. Algunos ensayos (por ejemplo, ensayos bioquímicos) pueden ser similares al análisis químico y la titulación . Sin embargo, los ensayos generalmente involucran material biológico o fenómenos que son intrínsecamente más complejos en composición o comportamiento, o ambos. Por tanto, la lectura de un ensayo puede ser ruidosa e implicar mayores dificultades de interpretación que una titulación química precisa. Por otro lado, los ensayos cualitativos de generaciones anteriores, especialmente los bioensayos , pueden ser mucho más burdos y menos cuantitativos (p. Ej., Contar la muerte o disfunción de un organismo o células en una población, o algún cambio descriptivo en alguna parte del cuerpo de un grupo de animales ).

Los ensayos se han convertido en una parte rutinaria de la tecnología médica , medioambiental , farmacéutica y forense moderna . Otras empresas también pueden emplearlos a nivel industrial , en la acera o en el campo. Los ensayos de alta demanda comercial se han investigado a fondo en los sectores de investigación y desarrollo de industrias profesionales. También han pasado por generaciones de desarrollo y sofisticación. En algunos casos, están protegidos por regulaciones de propiedad intelectual como las patentes otorgadas para invenciones . Estos ensayos a escala industrial a menudo se realizan en laboratorios bien equipados y con una organización automatizada del procedimiento, desde el pedido de un ensayo hasta el procesamiento preanalítico de muestras (recolección de muestras, manipulaciones necesarias, por ejemplo, centrifugado para separación , alícuotas si es necesario, almacenamiento, recuperación, etc.). pipeteo , aspiración , etc.). Los analitos generalmente se prueban en autoanalizadores de alto rendimiento , y los resultados se verifican y se devuelven automáticamente a los proveedores de servicios que los solicitan y a los usuarios finales . Esto es posible mediante el uso de un sistema informático de laboratorio avanzado que interactúa con múltiples terminales de computadora con usuarios finales, servidores centrales , los instrumentos físicos del autoanalizador y otros autómatas.

Etimología

Según Etymology Online, el verbo ensayo significa "probar, esforzarse, esforzarse, probar la calidad de"; del anglo-francés asaltante , de assai (sustantivo), del francés antiguo essai , "juicio". Así, el sustantivo ensayo significa "prueba, prueba de calidad, prueba de carácter" (desde mediados del siglo XIV), del anglo-francés assai ; y su significado "análisis" es de finales del siglo XIV.

Para el análisis de monedas, esto significaba literalmente el análisis de la pureza del oro o la plata (o cualquier componente precioso) que representaba el verdadero valor de la moneda. Esto podría haberse traducido más tarde (posiblemente después del siglo XIV) en un uso más amplio de "análisis", por ejemplo, en farmacología, el análisis de un componente importante de un objetivo dentro de una mezcla, como el ingrediente activo de un fármaco dentro de los excipientes inertes. en una formulación que previamente se midió solo de manera grosera por su acción observable en un organismo (por ejemplo, una dosis letal o una dosis inhibidora).

Pasos generales

Un ensayo (análisis) nunca es un proceso aislado, ya que debe ir acompañado de procedimientos pre y posanalíticos. Tanto el orden de comunicación (la solicitud para realizar un ensayo más la información relacionada) como el manejo de la muestra en sí (la recolección, documentación, transporte y procesamiento realizado antes de comenzar el ensayo) son pasos preanalíticos. De manera similar, una vez completado el ensayo, los resultados deben documentarse, verificarse y comunicarse: los pasos posanalíticos. Al igual que con cualquier sistema de transmisión y manipulación de información de varios pasos , la variación y los errores en el informe de los resultados finales implican no solo los intrínsecos al ensayo en sí, sino también los que ocurren en los procedimientos preanalíticos y posanalíticos.

Si bien los pasos analíticos del ensayo en sí reciben mucha atención, son los que reciben menos atención de la cadena de usuarios (los procedimientos preanalíticos y posanalíticos) los que generalmente acumulan la mayoría de los errores; por ejemplo, los pasos preanalíticos en los ensayos de laboratorio médico pueden contribuir del 32 al 75% de todos los errores de laboratorio.

Los ensayos pueden ser muy diversos, pero generalmente implican los siguientes pasos generales:

  1. Procesamiento y manipulación de muestras para presentar selectivamente el objetivo en una forma discernible o medible a un sistema de discriminación / identificación / detección. Puede implicar una simple separación centrífuga o lavado o filtración o captura mediante alguna forma de unión selectiva o incluso puede implicar modificar la diana, por ejemplo, recuperación de epítopos en ensayos inmunológicos o cortar la diana en trozos, por ejemplo, en espectrometría de masas . Por lo general, se realizan varios pasos separados antes de un ensayo y se denominan procesamiento preanalítico. Pero algunas de las manipulaciones pueden ser parte inseparable del ensayo en sí y, por lo tanto, no se considerarán preanalíticas.
  2. Principio de DISCRIMINACIÓN / IDENTIFICACIÓN específico del objetivo : para discriminar del fondo (ruido) de componentes similares e identificar específicamente un componente objetivo en particular ("analito") en un material biológico por sus atributos específicos. (por ejemplo, en un ensayo de PCR , un cebador de oligonucleótidos específico identifica la diana mediante el emparejamiento de bases basándose en la secuencia de nucleótidos específica única para la diana).
  3. Sistema de AMPLIFICACIÓN de señal (o diana) : la presencia y cantidad de ese analito se convierte en una señal detectable que generalmente implica algún método de amplificación de señal, de modo que se puede discriminar fácilmente del ruido y medirlo, por ejemplo, en un ensayo de PCR entre una mezcla de Las secuencias de ADN solo el objetivo específico se amplifican en millones de copias por una enzima ADN polimerasa de modo que se pueda discernir como un componente más prominente en comparación con cualquier otro componente potencial. A veces, la concentración del analito es demasiado grande y, en ese caso, el ensayo puede implicar la dilución de la muestra o algún tipo de sistema de disminución de la señal que es una amplificación negativa.
  4. Sistema de DETECCIÓN (e interpretación) de señales : Un sistema para descifrar la señal amplificada en una salida interpretable que puede ser cuantitativa o cualitativa. Pueden ser métodos visuales o manuales muy toscos o pueden ser detectores electrónicos digitales o analógicos muy sofisticados.
  5. La mejora de la señal y el filtrado de ruido se pueden realizar en cualquiera o en todos los pasos anteriores. Dado que cuanto más aguas abajo es un paso / proceso durante un ensayo, mayor es la posibilidad de traspasar el ruido del proceso anterior y amplificarlo, múltiples pasos en un ensayo sofisticado pueden involucrar varios medios de arreglos de mejora / nitidez específicos de la señal y reducción de ruido o arreglos de filtrado. Estos pueden ser simplemente en forma de un filtro óptico de paso de banda estrecho , o un reactivo de bloqueo en una reacción de unión que previene la unión inespecífica o un reactivo de extinción en un sistema de detección de fluorescencia que previene la "autofluorescencia" de los objetos de fondo.

Tipos de análisis basados ​​en la naturaleza del proceso de análisis

Hora y número de mediciones realizadas

Dependiendo de si un ensayo solo mira en un solo punto de tiempo o lecturas cronometradas tomadas en múltiples puntos de tiempo, un ensayo puede ser:

  1. Un ensayo de punto final , en el que se realiza una única medición después de un período de incubación fijo; o
  2. Un ensayo cinético , en el que las mediciones se realizan varias veces durante un intervalo de tiempo fijo. Los resultados del ensayo cinético pueden visualizarse numéricamente (por ejemplo, como un parámetro de pendiente que representa la tasa de cambio de la señal a lo largo del tiempo) o gráficamente (por ejemplo, como un gráfico de la señal medida en cada punto de tiempo). Para los ensayos cinéticos, tanto la magnitud como la forma de la respuesta medida a lo largo del tiempo proporcionan información importante.
  3. Un ensayo de alto rendimiento puede ser un criterio de valoración o un ensayo cinético que normalmente se realiza en una plataforma automatizada en formatos de microplacas de 96, 384 o 1536 pocillos ( cribado de alto rendimiento ). Dichos ensayos pueden probar un gran número de compuestos o analitos o realizar lecturas biológicas funcionales en respuesta a un estímulo y / o compuestos que se están probando.

Número de analitos detectados

Dependiendo de cuántos objetivos o analitos se midan:

  1. Los ensayos habituales son ensayos simples o de un solo objetivo, que suelen ser los predeterminados, a menos que se denominen múltiplex.
  2. Los ensayos multiplex se utilizan para medir simultáneamente la presencia, concentración, actividad o calidad de múltiples analitos en una sola prueba. El advenimiento de la multiplexación permitió realizar pruebas de muestras rápidas y eficientes en muchos campos, incluidos inmunología, citoquímica, genética / genómica, farmacocinética y toxicología.

Tipo de resultado

Dependiendo de la calidad del resultado producido, los ensayos pueden clasificarse en:

  1. Ensayos cualitativos , es decir, ensayos que generalmente dan sólo un pasa o no, o positivo o negativo o algún tipo de un pequeño número de gradación cualitativa en lugar de una cantidad exacta.
  2. Ensayos semicuantitativos , es decir, ensayos que dan la lectura de forma aproximada en lugar de un número exacto de la cantidad de sustancia. Generalmente tienen algunas gradaciones más que solo dos resultados, positivos o negativos, por ejemplo, puntuando en una escala de 1+ a 4+ como se usa para las pruebas de agrupación sanguínea basadas en la aglutinación de glóbulos rojos en respuesta a reactivos de agrupación (anticuerpos contra antígenos de grupos sanguíneos).
  3. Ensayos cuantitativos , es decir, ensayos que dan una medida cuantitativa numérica exacta y exacta de la cantidad de una sustancia en una muestra. Un ejemplo de tal ensayo usado en laboratorios de ensayo de coagulación para la enfermedad más común de sangrado heredado - enfermedad de Von Willebrand es VWF antígeno ensayo en el que la cantidad de vWF presente en una muestra de sangre se mide por un inmunoensayo.
  4. Ensayos funcionales , es decir, un ensayo que intenta cuantificar el funcionamiento de una sustancia activa en lugar de solo su cantidad. La contraparte funcional del ensayo de antígeno del FvW es el ensayo del cofactor de ristocetina , que mide la actividad funcional del FvW presente en el plasma de un paciente mediante la adición de plaquetas fijadas con formalina exógena y aumentando gradualmente las cantidades del fármaco denominado ristocetina mientras se mide la aglutinación de las plaquetas fijadas. Un ensayo similar pero utilizado para un propósito diferente se llama Agregación plaquetaria inducida por ristocetina o RIPA, que prueba la respuesta de plaquetas vivas endógenas de un paciente en respuesta a ristocetina (exógena) y VWF (generalmente endógeno).

Tipo y método de muestra

Dependiendo del sustrato general sobre el que se aplica el principio de ensayo:

  1. Bioensayo : cuando la respuesta es la actividad biológica de objetos vivos. Ejemplos incluyen
    1. in vivo , organismo completo (por ejemplo, ratón u otro sujeto inyectado con un fármaco)
    2. parte del cuerpo ex vivo (por ejemplo, pata de rana)
    3. órgano ex vivo (por ejemplo, corazón de un perro)
    4. ex vivo parte de un órgano (por ejemplo, un segmento de un intestino).
    5. tejido (por ejemplo, lisado de limulus)
    6. célula (por ejemplo, plaquetas)
  2. Ensayo de unión de ligando cuando un ligando (generalmente una molécula pequeña) se une a un receptor (generalmente una proteína grande).
  3. Inmunoensayo cuando la respuesta es una reacción de tipo de unión a antígeno-anticuerpo.

Amplificación de señal

Dependiendo de la naturaleza del sistema de amplificación de señales, los ensayos pueden ser de numerosos tipos, por nombrar algunos:

  1. Ensayo enzimático : las enzimas pueden probarse por su actividad altamente repetitiva en una gran cantidad de sustratos cuando la pérdida de un sustrato o la fabricación de un producto puede tener un atributo medible como el color o la absorbancia a una longitud de onda o luz particular o electroquimioluminiscencia o electricidad / redox. actividad.
  2. Sistemas de detección de luz que pueden utilizar amplificación, por ejemplo, mediante un fotodiodo o un tubo fotomultiplicador o un dispositivo de carga acoplada refrigerada .
  3. Sustratos marcados con radioisótopos utilizados en radioinmunoensayos y ensayos de diálisis de equilibrio y pueden detectarse mediante amplificación en contadores gamma o placas de rayos X , o fosforimager.
  4. Ensayos de reacción en cadena de la polimerasa que amplifican una diana de ADN (o ARN) en lugar de la señal
  5. Métodos combinados Los ensayos pueden utilizar una combinación de los métodos de amplificación anteriores y otros para mejorar la sensibilidad. por ejemplo , inmunoensayo ligado a enzimas o EIA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas .

Método o tecnología de detección

Dependiendo de la naturaleza del sistema de detección, los ensayos pueden basarse en:

  1. Formación de colonias o recuento de colonias virtuales : por ejemplo, multiplicando bacterias o proliferando células.
  2. Fotometría / espectrofotometría Cuando se mide la absorbancia de una longitud de onda específica de luz mientras pasa a través de una longitud de trayectoria fija a través de una cubeta de muestra líquida de prueba y la absorbancia se compara con un blanco y patrones con cantidades graduadas del compuesto objetivo. Si la luz emitida es de una longitud de onda visible específica, se puede llamar colorimetría , o puede implicar una longitud de onda de luz específica, por ejemplo, mediante el uso de láser y la emisión deseñales fluorescentes de otra longitud de onda específica que se detecta mediante filtros ópticos de longitud de onda muy específicos.
  3. La transmitancia de luz puede usarse para medir, por ejemplo, la eliminación de la opacidad de un líquido creado por partículas en suspensión debido a la disminución del número de grumos durante unareacción de aglutinación de plaquetas.
  4. Turbidimetría cuando la opacidad de la luz transmitida directamente que pasa a través de una muestra líquida se mide mediante detectores colocados directamente a través de la fuente de luz.
  5. Nefelometría, en la que se mide la cantidad de dispersión de luz que se produce cuando un haz de luz pasa a través de la solución para determinar el tamaño y / o la concentración y / o la distribución del tamaño de las partículas en la muestra.
  6. Reflectometría Cuando se evalúa el color de la luz reflejada de una muestra (generalmente seca) o reactivo, por ejemplo, las lecturas automáticas de los análisis de tira reactiva de orina.
  7. Mediciones viscoelásticas por ejemplo viscosimetría, elastografía (por ejemplo tromboelastografía )
  8. Ensayos de recuento: por ejemplo , contadores de células o partículas de citometría de flujo óptico , o contadores de células basados ​​en el principio de corte / impedancia
  9. Ensayos de imágenes, que implican el análisis de imágenes de forma manual o mediante software:
    1. Citometría : cuando un procesador de imágenes evalúa las estadísticas de tamaño de las células.
  10. Detección eléctrica por ejemplo, la participación de amperometría , voltametría , coulometría se puede utilizar directa o indirectamente para muchos tipos de mediciones cuantitativas.
  11. Otros ensayos basados ​​en propiedades físicas pueden utilizar
    1. Osmómetro
    2. Viscosímetro
    3. Electrodos selectivos de iones
    4. Prueba sindrómica

Tipos de ensayo basados ​​en los objetivos que se miden

ADN

Los ensayos para estudiar las interacciones de las proteínas con el ADN incluyen:

Proteína

ARN

Ensayos de recuento celular, viabilidad, proliferación o citotoxicidad

Un ensayo de células de recuento puede determinar el número de células vivas, el número de células muertas, o la relación de un tipo celular a otro, como numeradores y escribiendo rojo frente a diferentes tipos de blancos glóbulos . Esto se mide mediante diferentes métodos físicos (transmisión de luz, cambio de corriente eléctrica). Pero otros métodos utilizan la estructura o fisiología celular de sondeo bioquímico (tinciones). Otra aplicación es la monitorización de cultivos celulares ( ensayos de proliferación celular o citotoxicidad ). Un ensayo de citotoxicidad mide qué tan tóxico es un compuesto químico para las células .

Contaminantes ambientales o alimentarios

Tensioactivos

Otros ensayos de células

Se han desarrollado muchos ensayos celulares para evaluar parámetros específicos o la respuesta de las células ( biomarcadores , fisiología celular ). Las técnicas utilizadas para estudiar las células incluyen:

Ensayo de metástasis

Petroquímica

Virología

El ensayo de título viral basado en HPCE utiliza un sistema de electroforesis capilar de alto rendimiento patentado para determinar el título de baculovirus .

El ensayo Trofile se utiliza para determinar el tropismo del VIH .

El ensayo de placa viral consiste en calcular el número de virus presentes en una muestra. En esta técnica se cuenta el número de placas virales formadas por un inóculo viral, a partir de las cuales se puede determinar la concentración real del virus.

Secreciones celulares

Se puede detectar una amplia gama de secreciones celulares (por ejemplo, un anticuerpo específico o una citocina ) utilizando la técnica ELISA . El número de células que secretan esas sustancias particulares se puede determinar usando una técnica relacionada, el ensayo ELISPOT .

Drogas

Calidad

Cuando múltiples ensayos miden el mismo objetivo, sus resultados y utilidad pueden o no ser comparables dependiendo de la naturaleza del ensayo y su metodología, confiabilidad, etc. Tales comparaciones son posibles mediante el estudio de los atributos generales de calidad de los ensayos, por ejemplo, principios de medición (incluyendo identificación, amplificación y detección), rango dinámico de detección (generalmente el rango de linealidad de la curva estándar ), sensibilidad analítica , sensibilidad funcional , especificidad analítica , valores predictivos positivos y negativos , tiempo de respuesta, es decir, tiempo necesario para terminar un ciclo completo desde los pasos preanalíticos hasta el final del último paso posanalítico (envío / transmisión del informe), rendimiento , es decir, número de ensayos realizados por unidad de tiempo (generalmente expresado como por hora), etc. Organizaciones o laboratorios que realizan ensayos con fines profesionales, por ejemplo, diagnóstico médico y El pronóstico, el análisis ambiental, el procedimiento forense, la investigación y el desarrollo farmacéuticos deben ser go procedimientos de garantía de calidad bien regulados , incluida la validación de métodos , la calibración regular , el control de calidad analítico , las pruebas de aptitud , la acreditación de pruebas , la concesión de licencias de pruebas y deben documentar las certificaciones adecuadas de los organismos reguladores pertinentes para establecer la confiabilidad de sus ensayos, especialmente para seguir siendo legalmente aceptables y responsable de la calidad de los resultados del ensayo y también de convencer a los clientes de que utilicen su ensayo comercial / profesionalmente.

Lista de bases de datos de bioensayos

Bases de datos de bioactividad

Las bases de datos de bioactividad correlacionan estructuras u otra información química con los resultados de bioactividad tomados de bioensayos en la literatura, patentes y programas de detección.

Nombre Desarrollador (es) Versión inicial
ScrubChem Jason Bret Harris 2016
PubChem-BioAssay NIH  2004
CHEMBL EMBL-EBI 2009

Bases de datos de protocolo

Las bases de datos de protocolos correlacionan los resultados de los bioensayos con sus metadatos sobre condiciones experimentales y diseños de protocolos.

Nombre Desarrollador (es) Versión inicial
BioMetaData o BioAssay Express Descubrimiento colaborativo de fármacos 2016
PubChem-BioAssay NIH  2004

Ver también

Referencias

enlaces externos

  • Blair, Andrew Alexander (1911). "Ensayo"  . En Chisholm, Hugh (ed.). Encyclopædia Britannica . 2 (11ª ed.). Prensa de la Universidad de Cambridge. págs. 776–778. Esto incluye una explicación técnica detallada de las técnicas contemporáneas de análisis de minerales metálicos.
  • La definición del diccionario de ensayo en Wikcionario