Recombinación homóloga - Homologous recombination

Representación del cromosoma 1 después de someterse a una recombinación homóloga en la meiosis
Figura 1. Durante la meiosis , la recombinación homóloga puede producir nuevas combinaciones de genes como se muestra aquí entre copias similares pero no idénticas del cromosoma 1 humano .

La recombinación homóloga es un tipo de recombinación genética en la que se intercambia información genética entre dos moléculas similares o idénticas de ácidos nucleicos bicatenarios o monocatenarios (generalmente ADN como en organismos celulares pero también puede ser ARN en virus ). Es ampliamente utilizado por las células para reparar con precisión las roturas dañinas que ocurren en ambas hebras de ADN, conocidas como roturas de doble hebra (DSB), en un proceso llamado reparación recombinacional homóloga (HRR). La recombinación homóloga también produce nuevas combinaciones de secuencias de ADN durante la meiosis , el proceso por el cual los eucariotas producen células de gametos , como los espermatozoides y los óvulos en los animales. Estas nuevas combinaciones de ADN representan la variación genética en la descendencia, lo que a su vez permite que las poblaciones se adapten durante el curso de la evolución . La recombinación homóloga también se utiliza en la transferencia horizontal de genes para intercambiar material genético entre diferentes cepas y especies de bacterias y virus.

Aunque la recombinación homóloga varía ampliamente entre diferentes organismos y tipos de células, para el ADN bicatenario ( dsDNA ) la mayoría de las formas implican los mismos pasos básicos. Después de que ocurre una rotura de doble hebra, las secciones de ADN alrededor de los extremos 5 ' de la rotura se cortan en un proceso llamado resección . En el paso de invasión de la hebra que sigue, un extremo 3 'que sobresale de la molécula de ADN rota entonces "invade" una molécula de ADN similar o idéntica que no está rota. Después de la invasión de la hebra, la secuencia adicional de eventos puede seguir cualquiera de las dos vías principales que se describen a continuación (ver Modelos ); la vía DSBR (reparación de rotura de doble cadena) o la vía SDSA (hibridación de cadena dependiente de síntesis). La recombinación homóloga que ocurre durante la reparación del ADN tiende a dar como resultado productos que no se cruzan, restaurando de hecho la molécula de ADN dañada tal como existía antes de la rotura de la doble hebra.

La recombinación homóloga se conserva en los tres dominios de la vida, así como en los virus de ADN y ARN , lo que sugiere que es un mecanismo biológico casi universal. El descubrimiento de genes para la recombinación homóloga en protistas —un grupo diverso de microorganismos eucariotas— se ha interpretado como evidencia de que la meiosis surgió temprano en la evolución de los eucariotas. Dado que su disfunción se ha asociado fuertemente con una mayor susceptibilidad a varios tipos de cáncer , las proteínas que facilitan la recombinación homóloga son temas de investigación activa. La recombinación homóloga también se usa en el direccionamiento de genes , una técnica para introducir cambios genéticos en organismos objetivo. Por su desarrollo de esta técnica, Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 ; Capecchi y Smithies descubrieron de forma independiente aplicaciones en células madre embrionarias de ratón, sin embargo, los mecanismos altamente conservados que subyacen al modelo de reparación de DSB, incluida la integración homóloga uniforme del ADN transformado (terapia génica), se mostraron por primera vez en experimentos de plásmidos realizados por Orr-Weaver, Szostack y Rothstein. La investigación del DSB inducido por plásmido, utilizando irradiación γ en las décadas de 1970 y 1980, condujo a experimentos posteriores con endonucleasas (por ejemplo, I-SceI) para cortar cromosomas para la ingeniería genética de células de mamíferos, donde la recombinación no homóloga es más frecuente que en la levadura.

Historia y descubrimiento

Figura 2. Una ilustración temprana del cruce de Thomas Hunt Morgan

A principios de la década de 1900, William Bateson y Reginald Punnett encontraron una excepción a uno de los principios de herencia descritos originalmente por Gregor Mendel en la década de 1860. En contraste con la noción de Mendel de que los rasgos se clasifican de forma independiente cuando se transmiten de padres a hijos (por ejemplo, que el color del pelo de un gato y la longitud de la cola se heredan de forma independiente), Bateson y Punnett demostraron que ciertos genes asociados con los rasgos físicos se pueden heredar juntos o ligado genéticamente . En 1911, después de observar que los rasgos vinculados en ocasiones podrían heredarse por separado, Thomas Hunt Morgan sugirió que pueden ocurrir " cruces " entre genes vinculados, donde uno de los genes vinculados cruza físicamente a un cromosoma diferente . Dos décadas más tarde, Barbara McClintock y Harriet Creighton demostraron que el cruce cromosómico ocurre durante la meiosis , el proceso de división celular mediante el cual se producen los espermatozoides y los óvulos . En el mismo año del descubrimiento de McClintock, Curt Stern demostró que el cruzamiento, que más tarde se denominó "recombinación", también podría ocurrir en células somáticas como los glóbulos blancos y las células de la piel que se dividen a través de la mitosis .

En 1947, el microbiólogo Joshua Lederberg demostró que las bacterias —que se suponía que se reproducían solo asexualmente a través de la fisión binaria— son capaces de recombinación genética, que es más similar a la reproducción sexual. Este trabajo estableció a E. coli como un organismo modelo en genética y ayudó a Lederberg a ganar el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1958 . Sobre la base de estudios en hongos , en 1964 Robin Holliday propuso un modelo para la recombinación en la meiosis que introdujo detalles clave de cómo puede funcionar el proceso, incluido el intercambio de material entre cromosomas a través de las uniones de Holliday . En 1983, Jack Szostak y sus colegas presentaron un modelo ahora conocido como la vía DSBR , que contabilizaba las observaciones no explicadas por el modelo de Holliday. Durante la siguiente década, los experimentos en Drosophila , levadura en ciernes y células de mamíferos llevaron al surgimiento de otros modelos de recombinación homóloga, llamados vías SDSA , que no siempre se basan en las uniones de Holliday.

Gran parte del trabajo posterior en la identificación de proteínas involucradas en el proceso y la determinación de sus mecanismos ha sido realizado por varios individuos, incluidos James Haber , Patrick Sung , Stephen Kowalczykowski y otros.

En eucariotas

La recombinación homóloga (HR) es esencial para la división celular en eucariotas como plantas, animales, hongos y protistas. En las células que se dividen a través de la mitosis , la recombinación homóloga repara las roturas de doble hebra en el ADN causadas por la radiación ionizante o sustancias químicas que dañan el ADN. Si no se reparan, estas roturas de doble hebra pueden provocar un reordenamiento a gran escala de los cromosomas en las células somáticas , lo que a su vez puede provocar cáncer.

Además de reparar el ADN, la recombinación homóloga también ayuda a producir diversidad genética cuando las células se dividen en la meiosis para convertirse en células gametas especializadas : espermatozoides u óvulos en animales, polen u óvulos en plantas y esporas en hongos . Lo hace facilitando el cruce cromosómico , en el que se intercambian regiones de ADN similar pero no idéntico entre cromosomas homólogos . Esto crea nuevas combinaciones de genes, posiblemente beneficiosas, que pueden dar a la descendencia una ventaja evolutiva. El cruce cromosómico a menudo comienza cuando una proteína llamada Spo11 hace una ruptura de doble hebra específica en el ADN. Estos sitios están ubicados de forma no aleatoria en los cromosomas; por lo general en regiones promotoras intergénicas y preferentemente en dominios ricos en GC Estos sitios de ruptura de doble hebra a menudo ocurren en puntos calientes de recombinación , regiones en cromosomas que tienen alrededor de 1000 a 2000 pares de bases de longitud y tienen altas tasas de recombinación. La ausencia de un punto caliente de recombinación entre dos genes en el mismo cromosoma a menudo significa que esos genes serán heredados por generaciones futuras en igual proporción. Esto representa un vínculo entre los dos genes mayor de lo que cabría esperar de los genes que se agrupan de forma independiente durante la meiosis.

Sincronización dentro del ciclo celular mitótico

Figura 3. La recombinación homóloga repara el ADN antes de que la célula entre en mitosis (fase M). Ocurre solo durante y poco después de la replicación del ADN , durante las fases S y G 2 del ciclo celular .

Las roturas de doble hebra se pueden reparar mediante recombinación homóloga, unión de extremos mediada por polimerasa theta (TMEJ) o mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ). NHEJ es un mecanismo de reparación del ADN que, a diferencia de la recombinación homóloga, no requiere una secuencia homóloga larga para guiar la reparación. El uso de recombinación homóloga o NHEJ para reparar roturas de doble cadena depende en gran medida de la fase del ciclo celular . La recombinación homóloga repara el ADN antes de que la célula entre en mitosis (fase M). Ocurre durante y poco después de la replicación del ADN , en las fases S y G 2 del ciclo celular, cuando las cromátidas hermanas están más fácilmente disponibles. En comparación con los cromosomas homólogos, que son similares a otro cromosoma pero a menudo tienen alelos diferentes , las cromátidas hermanas son una plantilla ideal para la recombinación homóloga porque son una copia idéntica de un cromosoma dado. Cuando no hay una plantilla homóloga disponible o cuando no se puede acceder a la plantilla debido a un defecto en la recombinación homóloga, la ruptura se repara mediante TMEJ en las fases S y G 2 del ciclo celular. En contraste con la recombinación homóloga y TMEJ, NHEJ predomina en la fase G 1 del ciclo celular, cuando la célula está creciendo pero aún no está lista para dividirse. Ocurre con menos frecuencia después de la fase G 1 , pero mantiene al menos algo de actividad a lo largo del ciclo celular. Los mecanismos que regulan la recombinación homóloga y el NHEJ a lo largo del ciclo celular varían ampliamente entre especies.

Las quinasas dependientes de ciclina (CDK), que modifican la actividad de otras proteínas añadiéndoles grupos fosfato (es decir, fosforilándolas ), son importantes reguladores de la recombinación homóloga en eucariotas. Cuando la replicación del ADN comienza en la levadura en gemación, la quinasa dependiente de ciclina Cdc28 comienza la recombinación homóloga mediante la fosforilación de la proteína Sae2 . Después de ser activado por la adición de un fosfato, Sae2 hace que se haga un corte limpio cerca de una ruptura de doble hebra en el ADN. No está claro si la endonucleasa responsable de este corte es la propia Sae2 u otra proteína, Mre11 . Esto permite que un complejo de proteínas que incluye Mre11, conocido como complejo MRX , se una al ADN y comience una serie de reacciones impulsadas por proteínas que intercambian material entre dos moléculas de ADN.

El papel de la cromatina

El empaquetado de ADN eucariota en cromatina presenta una barrera para todos los procesos basados ​​en ADN que requieren el reclutamiento de enzimas en sus sitios de acción. Para permitir la reparación del ADN de recombinación homóloga (HR), se debe remodelar la cromatina. En eucariotas, los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP y las enzimas modificadoras de histonas son dos factores predominantes empleados para lograr este proceso de remodelado.

La relajación de la cromatina se produce rápidamente en el lugar del daño del ADN. En uno de los primeros pasos, la proteína quinasa activada por estrés, la quinasa c-Jun N-terminal (JNK) , fosforila SIRT6 en la serina 10 en respuesta a roturas de doble cadena u otros daños en el ADN. Esta modificación postraduccional facilita la movilización de SIRT6 a los sitios de daño del ADN y es necesaria para el reclutamiento eficaz de la poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) en los sitios de rotura del ADN y para la reparación eficaz de los DSB. La proteína PARP1 comienza a aparecer en los sitios de daño del ADN en menos de un segundo, con la mitad de la acumulación máxima en 1,6 segundos después de que ocurre el daño. A continuación, el remodelador de cromatina Alc1 se adhiere rápidamente al producto de la acción de PARP1, una cadena de ribosa de poli-ADP, y Alc1 completa la llegada al daño del ADN dentro de los 10 segundos posteriores a la aparición del daño. Aproximadamente la mitad de la relajación máxima de la cromatina, presumiblemente debido a la acción de Alc1, se produce a los 10 segundos. Esto luego permite el reclutamiento de la enzima de reparación del ADN MRE11 , para iniciar la reparación del ADN, en 13 segundos.

γH2AX, la forma fosforilada de H2AX también participa en los primeros pasos que conducen a la descondensación de la cromatina después de la rotura de la doble cadena del ADN. La variante de histona H2AX constituye aproximadamente el 10% de las histonas H2A en la cromatina humana. γH2AX (H2AX fosforilado en serina 139) puede detectarse tan pronto como 20 segundos después de la irradiación de las células (con formación de rotura de doble hebra del ADN), y la mitad de la acumulación máxima de γH2AX ocurre en un minuto. El grado de cromatina con γH2AX fosforilado es de aproximadamente dos millones de pares de bases en el sitio de una ruptura de la doble hebra del ADN. γH2AX, por sí mismo, no causa la descondensación de la cromatina, pero dentro de los 30 segundos posteriores a la irradiación, la proteína RNF8 puede detectarse en asociación con γH2AX. RNF8 media la descondensación extensa de cromatina, a través de su interacción posterior con CHD4 , un componente de la remodelación del nucleosoma y del complejo de desacetilasa NuRD .

Después de experimentar la relajación posterior al daño del ADN, seguida de la reparación del ADN, la cromatina se recupera a un estado de compactación cercano a su nivel anterior al daño después de aproximadamente 20 minutos.

Recombinación homóloga durante la meiosis

En los vertebrados, las ubicaciones en las que se produce la recombinación están determinadas por las ubicaciones de unión de PRDM9 , una proteína que reconoce un motivo de secuencia específico por su matriz de dedos de zinc. En estos sitios, otra proteína, la SPO11 , cataliza las roturas de doble hebra (DSB) que inician la recombinación, un subconjunto de las cuales se repara mediante recombinación con el cromosoma homólogo. PRDM9 deposita marcas de metilación de histonas H3K4me3 y H3K36me3 en los sitios a los que se une, y esta actividad de metiltransferasa es esencial para su papel en el posicionamiento de DSB. Después de su formación, los sitios DSB se procesan mediante resección, lo que da como resultado ADN de una sola hebra (ssDNA) que se decora con DMC1. Desde el cigoteno medio hasta el paquiteno temprano, como parte del proceso de reparación recombinacional, DMC1 se disocia del ADNss y los recuentos disminuyen hasta que todas las roturas (excepto las de los cromosomas XY) se reparan en el paquiteno tardío. Varias otras proteínas están involucradas en este proceso, incluida la ZCWPW1, la primera proteína colocada directamente por las marcas de histonas duales de PRDM9. ZCWPW1 es importante para la reparación de DSB homóloga, no para el posicionamiento.

Modelos

Figura 4. Modelos de reparación de rotura de doble hebra que actúan mediante recombinación homóloga

Dos modelos principales de cómo la recombinación homóloga repara las roturas de doble hebra en el ADN son la vía de reparación de rotura de doble hebra (DSBR) (a veces llamada modelo de unión doble de Holliday ) y la vía de hibridación de cadena dependiente de síntesis (SDSA). Las dos vías son similares en sus primeros pasos. Después de que ocurre una ruptura de doble hebra, el complejo MRX (complejo MRN en humanos) se une al ADN en ambos lados de la ruptura. A continuación, se lleva a cabo una resección, en la que se corta el ADN alrededor de los extremos 5 'de la rotura. Esto ocurre en dos pasos distintos: primero, el complejo MRX recluta la proteína Sae2, y estas dos proteínas recortan los extremos 5 'a cada lado de la rotura para crear proyecciones cortas 3' de ADN monocatenario; en el segundo paso, 5 '→ 3' resección se continúa por el Sgs1 helicasa y las Exo1 y DNA2 nucleasas. Como helicasa , Sgs1 "descomprime" el ADN bicatenario , mientras que la actividad nucleasa de Exo1 y Dna2 les permite cortar el ADN monocatenario producido por Sgs1.

La proteína RPA , que tiene una alta afinidad por el ADN monocatenario, se une a los salientes 3 '. Con la ayuda de varias otras proteínas que median en el proceso, la proteína Rad51 (y Dmc1 , en la meiosis) luego forma un filamento de ácido nucleico y proteína en la hebra simple de ADN recubierta con RPA. Este filamento de nucleoproteína comienza a buscar secuencias de ADN similares a la del saliente 3 '. Después de encontrar tal secuencia, el filamento de nucleoproteína monocatenario se mueve hacia (invade) el dúplex de ADN receptor similar o idéntico en un proceso llamado invasión de cadena . En las células que se dividen por mitosis, el dúplex de ADN del receptor es generalmente una cromátida hermana, que es idéntica a la molécula de ADN dañada y proporciona una plantilla para la reparación. En la meiosis, sin embargo, el ADN del receptor tiende a ser de un cromosoma homólogo similar pero no necesariamente idéntico. Se forma un bucle de desplazamiento (bucle D) durante la invasión de la hebra entre la hebra que sobresale 3 'invasora y el cromosoma homólogo. Después de la invasión de la hebra, una ADN polimerasa extiende el extremo de la hebra 3 'invasora sintetizando nuevo ADN. Esto cambia el bucle en D a una estructura en forma de cruz conocida como cruce de Holliday . Después de esto, se produce más síntesis de ADN en la hebra invasora (es decir, uno de los salientes 3 'originales), restaurando eficazmente la hebra en el cromosoma homólogo que fue desplazado durante la invasión de la hebra.

Vía DSBR

Ver texto adyacente.
Figura 5. Las vías DSBR y SDSA siguen los mismos pasos iniciales, pero divergen a partir de entonces. La vía DSBR con mayor frecuencia da como resultado un cruce cromosómico (abajo a la izquierda), mientras que SDSA siempre termina con productos que no se cruzan (abajo a la derecha).

Después de las etapas de resección, invasión de hebras y síntesis de ADN, las vías DSBR y SDSA se vuelven distintas. La vía DSBR es única en el sentido de que el segundo saliente 3 '(que no participó en la invasión de la hebra) también forma una unión de Holliday con el cromosoma homólogo. Las uniones dobles de Holliday luego se convierten en productos de recombinación mediante el corte de endonucleasas , un tipo de endonucleasa de restricción que corta solo una hebra de ADN. La vía DSBR comúnmente da como resultado un cruce, aunque a veces puede resultar en productos no cruzados; la capacidad de una molécula de ADN rota para recolectar secuencias de loci de donantes separados se demostró en levadura mitótica en gemación usando plásmidos o inducción de endonucleasas de eventos cromosómicos. Debido a esta tendencia al cruzamiento cromosómico, la vía DSBR es un modelo probable de cómo se produce la recombinación homóloga cruzada durante la meiosis.

Si la recombinación en la vía DSBR da como resultado un cruce cromosómico está determinado por cómo se corta o se "resuelve" la doble unión de Holliday. Se producirá un cruce cromosómico si se corta una unión de Holliday en la hebra de cruce y la otra unión de Holliday se corta en la hebra que no se cruza (en la Figura 5, a lo largo de las puntas de flecha moradas horizontales en una unión de Holliday y a lo largo de las puntas de flecha anaranjadas verticales en la otra ). Alternativamente, si las dos uniones de Holliday se cortan en las hebras de cruce (a lo largo de las puntas de flecha moradas horizontales en ambas uniones de Holliday en la Figura 5), ​​se producirán cromosomas sin cruce.

Vía SDSA

La recombinación homóloga a través de la vía SDSA ocurre en las células que se dividen a través de la mitosis y la meiosis y da como resultado productos que no se cruzan. En este modelo, la cadena 3 'invasora se extiende a lo largo del dúplex de ADN del receptor mediante una ADN polimerasa y se libera cuando la unión de Holliday entre las moléculas de ADN del donante y el receptor se desliza en un proceso llamado migración de ramificación . El extremo 3 'recién sintetizado de la hebra invasora es entonces capaz de aparearse con el otro saliente 3' en el cromosoma dañado a través del emparejamiento de bases complementarias. Después de que las hebras se hibridan, a veces puede quedar un pequeño colgajo de ADN. Cualquiera de estos colgajos se quita, y la vía de SDSA termina con el resellado, también conocido como ligadura , de cualquier espacio restante de una sola hebra.

Durante la mitosis, la principal vía de recombinación homóloga para reparar roturas de doble cadena de ADN parece ser la vía SDSA (en lugar de la vía DSBR). La vía SDSA produce recombinantes no cruzados (Figura 5). Durante la meiosis, los recombinantes no cruzados también ocurren con frecuencia y estos parecen surgir también principalmente por la vía SDSA. Los eventos de recombinación no cruzada que ocurren durante la meiosis probablemente reflejan casos de reparación de daños de doble hebra del ADN u otros tipos de daños en el ADN.

Vía SSA

Imagen fija de una animación de la vía SSA.  Una sola molécula de ADN de doble hebra se muestra en rojo, orientada horizontalmente.  En cada una de las dos cadenas de ADN, se muestran dos regiones púrpuras que indican secuencias repetidas de ADN a la izquierda y a la derecha del centro de la molécula de ADN.
Figura 6. La recombinación a través de la vía SSA ocurre entre dos elementos repetidos (violeta) en el mismo dúplex de ADN y da como resultado deleciones de material genético. (Haga clic para ver el diagrama animado en los navegadores web Firefox , Chrome , Safari u Opera ).

La ruta de hibridación de una sola hebra (SSA) de recombinación homóloga repara las roturas de doble hebra entre dos secuencias repetidas . La vía SSA es única porque no requiere una molécula de ADN similar o idéntica separada, como las vías DSBR o SDSA de recombinación homóloga. En cambio, la vía SSA solo requiere un único dúplex de ADN y usa las secuencias repetidas como las secuencias idénticas que la recombinación homóloga necesita para su reparación. La vía es relativamente simple en concepto: después de que dos hebras del mismo dúplex de ADN se cortan alrededor del sitio de la rotura de la doble hebra, los dos salientes 3 'resultantes se alinean y aparean entre sí, restaurando el ADN como un dúplex continuo. .

A medida que se corta el ADN alrededor de la rotura de la doble hebra, los salientes 3 'monocatenarios que se producen se recubren con la proteína RPA , lo que evita que los salientes 3' se peguen a sí mismos. Luego, una proteína llamada Rad52 une cada una de las secuencias repetidas a cada lado de la ruptura y las alinea para permitir que las dos secuencias repetidas complementarias se hibriden. Una vez que se completa el apareamiento, los colgajos no homólogos sobrantes de los salientes 3 'se cortan mediante un conjunto de nucleasas, conocidas como Rad1 / Rad10 , que se llevan a los colgajos mediante las proteínas Saw1 y Slx4 . La nueva síntesis de ADN llena cualquier espacio y la ligadura restaura el dúplex de ADN como dos hebras continuas. La secuencia de ADN entre las repeticiones siempre se pierde, al igual que una de las dos repeticiones. La vía SSA se considera mutagénica ya que da lugar a tales deleciones de material genético.

Vía BIR

Durante la replicación del ADN , a veces se pueden encontrar roturas de doble hebra en las horquillas de replicación cuando la helicasa de ADN desabrocha la hebra molde. Estos defectos se reparan en la vía de replicación inducida por rotura (BIR) de la recombinación homóloga. Los mecanismos moleculares precisos de la vía BIR siguen sin estar claros. Tres mecanismos propuestos tienen la invasión de cadenas como paso inicial, pero difieren en cómo modelan la migración del bucle D y las fases posteriores de recombinación.

La vía BIR también puede ayudar a mantener la longitud de los telómeros (regiones de ADN al final de los cromosomas eucariotas) en ausencia de (o en cooperación con) telomerasa . Sin copias funcionales de la enzima telomerasa, los telómeros suelen acortarse con cada ciclo de mitosis, lo que finalmente bloquea la división celular y conduce a la senescencia . En las células de levadura en ciernes en las que la telomerasa ha sido inactivada mediante mutaciones, se ha observado que dos tipos de células "supervivientes" evitan la senescencia más de lo esperado alargando sus telómeros a través de las vías BIR.

Mantener la longitud de los telómeros es fundamental para la inmortalización celular , una característica clave del cáncer. La mayoría de los cánceres mantienen los telómeros regulando positivamente la telomerasa. Sin embargo, en varios tipos de cáncer humano, una vía similar a BIR ayuda a mantener algunos tumores al actuar como un mecanismo alternativo de mantenimiento de los telómeros. Este hecho ha llevado a los científicos a investigar si tales mecanismos de mantenimiento de los telómeros basados ​​en la recombinación podrían frustrar los medicamentos contra el cáncer como los inhibidores de la telomerasa .

En bacterias

Estructura cristalina de RecA unida al ADN.
Figura 7. Estructura cristalina de un filamento de proteína RecA unido a ADN. Un voladizo de 3 ' es visible a la derecha del centro.

La recombinación homóloga es un proceso importante de reparación del ADN en bacterias. También es importante para producir diversidad genética en poblaciones bacterianas, aunque el proceso difiere sustancialmente de la recombinación meiótica , que repara los daños del ADN y genera diversidad en los genomas eucariotas . La recombinación homóloga ha sido la más estudiada y se comprende mejor para Escherichia coli . Las roturas de ADN de doble hebra en bacterias se reparan mediante la vía RecBCD de recombinación homóloga. Se cree que las roturas que ocurren en solo una de las dos cadenas de ADN, conocidas como brechas de una sola cadena, son reparadas por la vía RecF . Tanto la vía RecBCD como la RecF incluyen una serie de reacciones conocidas como migración de ramificaciones , en las que se intercambian hebras simples de ADN entre dos moléculas entrecruzadas de ADN dúplex, y resolución , en la que esas dos moléculas de ADN entrecruzadas se cortan y restauran a su estado normal. Estado de doble hebra.

Vía RecBCD

Figura 8A. Modelo molecular para la vía de recombinación RecBCD. Este modelo se basa en reacciones de ADN y RecBCD con ATP en exceso sobre iones Mg2 +. Paso 1: RecBCD se une a un extremo de ADN de doble hebra. Paso 2: RecBCD desenrolla el ADN. RecD es una helicasa rápida en la hebra de extremo 5 ', y RecB es una helicasa más lenta en la hebra de extremo 3' (la que tiene una punta de flecha) [ref. 46 en la versión actual de Wiki]. Esto produce dos colas de ADN monocatenario (ss) y un bucle ss. El bucle y las colas se agrandan a medida que RecBCD se mueve a lo largo del ADN. Paso 3: Las dos colas se templan para producir un segundo bucle de ADN ss, y ambos bucles se mueven y crecen. Paso 4: Al llegar a la secuencia del punto de acceso Chi (5 'GCTGGTGG 3'; punto rojo) RecBCD corta la hebra de extremo 3 '. Si se desenrolla más, se produce una cola ss larga con un extremo de 3 'con Chi cerca del final. Paso 5: RecBCD carga la proteína RecA en la cola Chi. En algún punto indeterminado, las subunidades RecBCD se desmontan. Paso 6: El complejo RecA-ssDNA invade un ADN dúplex homólogo intacto para producir un bucle D, que puede resolverse en ADN recombinante intacto de dos formas. Paso 7: El bucle D se corta y se hibrida con el espacio en el primer ADN para producir una unión de Holliday. La resolución de la unión de Holliday (corte, intercambio de hebras y ligadura) en las puntas de flecha abiertas mediante alguna combinación de RuvABC y RecG produce dos recombinantes de tipo recíproco. Paso 8: El extremo 3 'de la cola de Chi prepara la síntesis de ADN, a partir del cual se puede generar una horquilla de replicación. La resolución de la bifurcación en las puntas de flecha abiertas produce un ADN recombinante (no recíproco), un ADN de tipo parental y un fragmento de ADN.
Ver leyenda.
Figura 8B. Inicio de la vía RecBCD. Este modelo se basa en reacciones de ADN y RecBCD con iones Mg 2+ en exceso sobre ATP. Paso 1: RecBCD se une a una rotura de doble hebra de ADN. Paso 2: RecBCD inicia el desenrollamiento del dúplex de ADN a través de la actividad helicasa dependiente de ATP . Paso 3: RecBCD continúa su desenrollado y desciende por el dúplex de ADN, escindiendo la hebra 3 'con mucha más frecuencia que la hebra 5'. Paso 4: RecBCD encuentra una secuencia Chi y deja de digerir la hebra 3 '; la escisión de la hebra 5 'aumenta significativamente. Paso 5: RecBCD carga RecA en la hebra de 3 '. Paso 6: RecBCD se separa del dúplex de ADN, dejando un filamento de nucleoproteína RecA en la cola 3 '.

La vía RecBCD es la principal vía de recombinación utilizada en muchas bacterias para reparar roturas de doble hebra en el ADN, y las proteínas se encuentran en una amplia gama de bacterias. Estas roturas de doble hebra pueden ser causadas por la luz ultravioleta y otras radiaciones , así como por mutágenos químicos . Las roturas de doble hebra también pueden surgir por la replicación del ADN a través de una muesca o un hueco de una hebra. Tal situación provoca lo que se conoce como una horquilla de replicación colapsada y se fija mediante varias vías de recombinación homóloga, incluida la vía RecBCD.

En esta vía, un complejo enzimático de tres subunidades llamado RecBCD inicia la recombinación al unirse a un extremo romo o casi romo de una ruptura en el ADN de doble hebra. Después de que RecBCD se une al extremo del ADN, las subunidades RecB y RecD comienzan a descomprimir el dúplex de ADN a través de la actividad helicasa . La subunidad RecB también tiene un dominio de nucleasa , que corta la hebra única de ADN que emerge del proceso de descompresión. Esta descompresión continúa hasta que RecBCD encuentra una secuencia de nucleótidos específica (5'-GCTGGTGG-3 ') conocida como sitio Chi .

Al encontrar un sitio Chi, la actividad de la enzima RecBCD cambia drásticamente. El desenrollado del ADN se detiene durante unos segundos y luego se reanuda aproximadamente a la mitad de la velocidad inicial. Esto se debe probablemente a que la helicasa RecB más lenta desenrolla el ADN después de Chi, en lugar de la helicasa RecD más rápida, que desenrolla el ADN antes que Chi. El reconocimiento del sitio Chi también cambia la enzima RecBCD para que corte la hebra de ADN con Chi y comience a cargar múltiples proteínas RecA en el ADN monocatenario con el extremo 3 'recién generado. El filamento de nucleoproteína recubierto de RecA resultante busca secuencias similares de ADN en un cromosoma homólogo. El proceso de búsqueda induce el estiramiento del dúplex de ADN, lo que mejora el reconocimiento de homología (un mecanismo denominado corrección conformacional ). Al encontrar dicha secuencia, el filamento de nucleoproteína monocatenario se mueve hacia el dúplex de ADN del receptor homólogo en un proceso llamado invasión de cadena . El saliente 3 'invasor hace que una de las hebras del dúplex de ADN receptor se desplace para formar un bucle D. Si se corta el bucle en D, otro intercambio de hebras forma una estructura en forma de cruz llamada unión de Holliday . La resolución de la unión de Holliday mediante alguna combinación de RuvABC o RecG puede producir dos moléculas de ADN recombinante con tipos genéticos recíprocos, si las dos moléculas de ADN que interactúan difieren genéticamente. Alternativamente, el extremo 3 'invasor cerca de Chi puede cebar la síntesis de ADN y formar una bifurcación de replicación. Este tipo de resolución produce solo un tipo de recombinante (no recíproco).

Vía RecF

Las bacterias parecen utilizar la vía RecF de recombinación homóloga para reparar los huecos de una sola hebra en el ADN. Cuando la vía RecBCD es inactivada por mutaciones y mutaciones adicionales inactivan las nucleasas SbcCD y ExoI, la vía RecF también puede reparar roturas de doble cadena del ADN. En la vía RecF, la helicasa RecQ desenrolla el ADN y la nucleasa RecJ degrada la hebra con un extremo 5 ', dejando la hebra con el extremo 3' intacto. La proteína RecA se une a esta hebra y es ayudada por las proteínas RecF, RecO y RecR o estabilizada por ellas. El filamento de nucleoproteína RecA busca un ADN homólogo e intercambia lugares con la hebra idéntica o casi idéntica en el ADN homólogo.

Aunque las proteínas y los mecanismos específicos involucrados en sus fases iniciales difieren, las dos vías son similares en el sentido de que ambas requieren ADN monocatenario con un extremo 3 'y la proteína RecA para la invasión de la cadena. Las vías también son similares en sus fases de migración de ramas , en las que la unión de Holliday se desliza en una dirección, y resolución , en la que las uniones de Holliday se separan por enzimas. El tipo de resolución alternativo, no recíproco también puede ocurrir por cualquier vía.

Migración de sucursales

Inmediatamente después de la invasión de la hebra, la unión de Holliday se mueve a lo largo del ADN enlazado durante el proceso de migración de la rama. Es en este movimiento de la unión de Holliday donde se intercambian los pares de bases entre los dos dúplex de ADN homólogos. Para catalizar la migración de las ramas, la proteína RuvA primero reconoce y se une a la unión de Holliday y recluta la proteína RuvB para formar el complejo RuvAB. Dos conjuntos de la proteína RuvB, cada uno de los cuales forma una ATPasa en forma de anillo , se cargan en lados opuestos de la unión de Holliday, donde actúan como bombas gemelas que proporcionan la fuerza para la migración de las ramas. Entre esos dos anillos de RuvB, dos conjuntos de la proteína RuvA se ensamblan en el centro de la unión de Holliday de modo que el ADN en la unión se intercala entre cada conjunto de RuvA. Las hebras de ambos dúplex de ADN, el dúplex "donante" y el "receptor", se desenrollan en la superficie de RuvA a medida que son guiadas por la proteína de un dúplex a otro.

Resolución

En la fase de resolución de la recombinación, se cortan todas las uniones de Holliday formadas por el proceso de invasión de cadenas, restaurando así dos moléculas de ADN separadas. Esta escisión se realiza mediante la interacción del complejo RuvAB con RuvC, que juntos forman el complejo RuvABC . RuvC es una endonucleasa que corta la secuencia degenerada 5 '- (A / T) TT (G / C) -3'. La secuencia se encuentra con frecuencia en el ADN, aproximadamente una vez cada 64 nucleótidos. Antes de cortar, RuvC probablemente obtenga acceso a la unión de Holliday desplazando uno de los dos tetrámeros de RuvA que cubren el ADN allí. La recombinación da como resultado productos de "empalme" o "parche", dependiendo de cómo RuvC escinde la unión de Holliday. Los productos de empalme son productos cruzados, en los que hay una reordenación del material genético alrededor del sitio de recombinación. Los productos de parche, por otro lado, son productos no cruzados en los que no existe tal reordenamiento y solo hay un "parche" de ADN híbrido en el producto de recombinación.

Facilitar la transferencia genética

La recombinación homóloga es un método importante para integrar el ADN del donante en el genoma de un organismo receptor en la transferencia horizontal de genes , el proceso mediante el cual un organismo incorpora ADN extraño de otro organismo sin ser descendiente de ese organismo. La recombinación homóloga requiere que el ADN entrante sea muy similar al genoma del receptor, por lo que la transferencia horizontal de genes generalmente se limita a bacterias similares. Los estudios en varias especies de bacterias han establecido que hay una disminución log-lineal en la frecuencia de recombinación con una diferencia creciente en la secuencia entre el ADN del huésped y del receptor.

En la conjugación bacteriana , donde el ADN se transfiere entre bacterias a través del contacto directo de célula a célula, la recombinación homóloga ayuda a integrar ADN extraño en el genoma del huésped a través de la vía RecBCD. La enzima RecBCD promueve la recombinación después de que el ADN se convierte del ADN monocatenario, en cuya forma ingresa originalmente a la bacteria, en ADN bicatenario durante la replicación. La vía RecBCD también es esencial para la fase final de transducción , un tipo de transferencia genética horizontal en la que el ADN es transferido de una bacteria a otra por un virus . El ADN bacteriano extraño a veces se incorpora incorrectamente en la cabeza de la cápside de las partículas del virus del bacteriófago a medida que el ADN se empaqueta en nuevos bacteriófagos durante la replicación viral. Cuando estos nuevos bacteriófagos infectan a otras bacterias, el ADN de la bacteria huésped anterior se inyecta en el nuevo huésped bacteriano como ADN de doble hebra. La enzima RecBCD luego incorpora este ADN de doble hebra en el genoma del nuevo huésped bacteriano.

Transformación bacteriana

La transformación bacteriana natural implica la transferencia de ADN de una bacteria donante a una bacteria receptora, donde tanto el donante como el receptor son normalmente de la misma especie . La transformación, a diferencia de la conjugación y transducción bacterianas, depende de numerosos productos génicos bacterianos que interactúan específicamente para realizar este proceso. Por tanto, la transformación es claramente una adaptación bacteriana para la transferencia de ADN. Para que una bacteria se una, absorba e integre el ADN del donante en su cromosoma residente mediante recombinación homóloga, primero debe entrar en un estado fisiológico especial denominado competencia . La familia de genes RecA / Rad51 / DMC1 juega un papel central en la recombinación homóloga durante la transformación bacteriana como lo hace durante la meiosis y mitosis eucariotas. Por ejemplo, la proteína RecA es esencial para la transformación en Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae , y la expresión del gen RecA se induce durante el desarrollo de la competencia para la transformación en estos organismos.

Como parte del proceso de transformación, la proteína RecA interactúa con el ADN monocatenario (ssDNA) entrante para formar nucleofilamentos RecA / ssDNA que escanean el cromosoma residente en busca de regiones de homología y llevan el ssDNA entrante a la región correspondiente, donde el intercambio de hebras y los homólogos ocurre la recombinación. Por tanto, el proceso de recombinación homóloga durante la transformación bacteriana tiene similitudes fundamentales con la recombinación homóloga durante la meiosis .

En virus

La recombinación homóloga ocurre en varios grupos de virus. En virus de ADN , como el herpesvirus , la recombinación se produce a través de un mecanismo de ruptura y unión como en bacterias y eucariotas. También hay evidencia de recombinación en algunos virus de ARN , específicamente virus de ARNm de sentido positivo como retrovirus , picornavirus y coronavirus . Existe controversia sobre si la recombinación homóloga ocurre en virus ssRNA de sentido negativo como la influenza .

En los virus de ARN, la recombinación homóloga puede ser precisa o imprecisa. En el tipo preciso de recombinación ARN-ARN, no hay diferencia entre las dos secuencias de ARN parentales y la región de ARN cruzada resultante. Debido a esto, a menudo es difícil determinar la ubicación de los eventos de cruzamiento entre dos secuencias de ARN recombinantes. En la recombinación homóloga de ARN imprecisa, la región de cruce tiene alguna diferencia con las secuencias de ARN parentales, causada por la adición, deleción u otra modificación de nucleótidos. El nivel de precisión en el cruce está controlado por el contexto de secuencia de las dos cadenas de ARN recombinantes: las secuencias ricas en adenina y uracilo disminuyen la precisión del cruce.

La recombinación homóloga es importante para facilitar la evolución viral . Por ejemplo, si los genomas de dos virus con diferentes mutaciones desventajosas se someten a recombinación, es posible que puedan regenerar un genoma completamente funcional. Alternativamente, si dos virus similares han infectado la misma célula huésped, la recombinación homóloga puede permitir que esos dos virus intercambien genes y, por lo tanto, desarrollen variaciones más potentes de sí mismos.

La recombinación homóloga es el mecanismo propuesto por el cual el virus del ADN herpesvirus-6 humano se integra en los telómeros humanos.

Cuando dos o más virus, cada uno de los cuales contiene daño genómico letal, infectan la misma célula huésped, los genomas del virus a menudo pueden emparejarse entre sí y sufrir una reparación recombinacional homóloga para producir una progenie viable. Este proceso, conocido como reactivación multiplicidad, se ha estudiado en varios bacteriófagos , incluido el fago T4 . Las enzimas empleadas en la reparación recombinacional en el fago T4 son funcionalmente homólogas a las enzimas empleadas en la reparación recombinacional bacteriana y eucariota. En particular, con respecto a un gen necesario para la reacción de intercambio de hebras, un paso clave en la reparación recombinacional homóloga, existe una homología funcional de virus a humanos (es decir, uvsX en el fago T4; recA en E. coli y otras bacterias, y rad51 y dmc1 en levaduras y otros eucariotas, incluidos los seres humanos). También se ha demostrado la reactivación de la multiplicidad en numerosos virus patógenos.

Coronavirus

Los coronavirus son capaces de recombinación genética cuando al menos dos genomas virales están presentes en la misma célula infectada. La recombinación de ARN parece ser una fuerza impulsora importante para determinar (1) la variabilidad genética dentro de una especie de CoV, (2) la capacidad de una especie de CoV para saltar de un huésped a otro y (3) con poca frecuencia, la aparición de nuevos CoV. El mecanismo de recombinación en CoV probablemente implica el cambio de plantilla durante la replicación del genoma. La recombinación en los virus de ARN parece ser una adaptación para hacer frente al daño del genoma.

El motivo de unión al receptor completo del SARS-CoV-2 pandémico parece haber sido introducido mediante recombinación de coronavirus de pangolines . Tal evento de recombinación puede haber sido un paso crítico en la evolución de la capacidad del SARS-CoV-2 para infectar a los humanos. Los eventos de recombinación son probablemente pasos clave en el proceso evolutivo que conduce a la aparición de nuevos coronavirus humanos.

Durante la pandemia de COVID-19 en 2020, muchas secuencias genómicas de aislados de SARS ‐ CoV ‐ 2 de Australia tienen deleciones o mutaciones (29742G> A o 29742G> U; "G19A" o "G19U") en el coronavirus 3 ′ tallo-lazo II- like motif (s2m) , un motivo de ARN en la región no traducida 3 'del genoma viral, lo que sugiere que los eventos de recombinación de ARN pueden haber ocurrido en s2m de SARS-CoV-2. Basado en el análisis computacional de 1319 secuencias de Australia SARS ‐ CoV ‐ 2 utilizando el algoritmo Recco ( https://recco.bioinf.mpi-inf.mpg.de/ ), 29742G ("G19"), 29744G ("G21") y Se predijo 29751G ("G28") como puntos calientes de recombinación.

Representación esquemática de la estructura secundaria del ARN s2m, con interacciones estructurales terciarias indicadas como contactos de largo alcance.

El brote de SARS-CoV-2 en el crucero Diamond Princess probablemente se originó en una sola persona infectada con una variante del virus idéntica a los aislados de Wuhan WIV04, o simultáneamente con otro caso primario infectado con un virus que contiene la mutación 11083G> T. El análisis de desequilibrio de ligamiento confirmó que la recombinación de ARN con la mutación 11083G> T también contribuyó al aumento de mutaciones entre la progenie viral. Los hallazgos indican que la mutación 11083G> T del SARS-CoV-2 se propagó durante la cuarentena a bordo y surgió a través de la recombinación de novo de ARN bajo presión de selección positiva. Además, en tres pacientes en este crucero, dos mutaciones 29736G> T y 29751G> T ("G13" y "G28") también se localizaron en el motivo de coronavirus 3 ′ tallo-bucle II (s2m) , como "G28". se predijo como puntos calientes de recombinación en mutantes australianos del SARS-CoV-2. Aunque s2m se considera un motivo de ARN altamente conservado entre muchas especies de coronavirus, este resultado también sugiere que s2m de SARS-CoV-2 es más bien un hotspot de recombinación / mutación de ARN .

Efectos de la disfunción

Figura 9. La unión de roturas de doble hebra de un solo extremo podría dar lugar a reordenamientos

Sin una recombinación homóloga adecuada, los cromosomas a menudo se alinean incorrectamente para la primera fase de la división celular en la meiosis . Esto hace que los cromosomas no se segreguen adecuadamente en un proceso llamado no disyunción . A su vez, la no disyunción puede hacer que los espermatozoides y los óvulos tengan muy pocos o demasiados cromosomas. El síndrome de Down , que es causado por una copia adicional del cromosoma 21 , es una de las muchas anomalías que resultan de tal falla en la recombinación homóloga en la meiosis.

Las deficiencias en la recombinación homóloga se han relacionado fuertemente con la formación de cáncer en humanos. Por ejemplo, cada una de las enfermedades relacionadas con el cáncer síndrome de Bloom , síndrome de Werner y síndrome de Rothmund-Thomson son causadas por errores copias de RecQ helicasa genes implicados en la regulación de la recombinación homóloga: BLM , WRN y RECQL4 , respectivamente. En las células de los pacientes con síndrome de Bloom, que carecen de una copia funcional de la proteína BLM, existe una tasa elevada de recombinación homóloga. Los experimentos en ratones deficientes en BLM han sugerido que la mutación da lugar al cáncer a través de una pérdida de heterocigosidad causada por un aumento de la recombinación homóloga. Una pérdida de heterocigosidad se refiere a la pérdida de una de dos versiones, o alelos, de un gen. Si uno de los alelos perdidos ayuda a suprimir los tumores, como el gen de la proteína del retinoblastoma, por ejemplo, la pérdida de heterocigosidad puede provocar cáncer.

La disminución de las tasas de recombinación homóloga provoca una reparación ineficaz del ADN, lo que también puede provocar cáncer. Este es el caso de BRCA1 y BRCA2 , dos genes supresores de tumores similares cuyo mal funcionamiento se ha relacionado con un riesgo considerablemente mayor de cáncer de mama y de ovario . Las células que carecen de BRCA1 y BRCA2 tienen una menor tasa de recombinación homóloga y una mayor sensibilidad a la radiación ionizante , lo que sugiere que la disminución de la recombinación homóloga conduce a una mayor susceptibilidad al cáncer. Debido a que la única función conocida de BRCA2 es ayudar a iniciar la recombinación homóloga, los investigadores han especulado que un conocimiento más detallado del papel de BRCA2 en la recombinación homóloga puede ser la clave para comprender las causas del cáncer de mama y de ovario.

Los tumores con una deficiencia de recombinación homóloga (incluidos los defectos de BRCA) se describen como positivos para HRD.

Conservación evolutiva

Gráfico que muestra las proteínas de cada dominio de la vida.  Cada proteína se muestra horizontalmente, con dominios homólogos en cada proteína indicados por color.
Figura 10. Los dominios proteicos en proteínas relacionadas con la recombinación homóloga se conservan en los tres grupos principales de vida: arqueas, bacterias y eucariotas.

Si bien las vías pueden variar mecánicamente, la capacidad de los organismos para realizar una recombinación homóloga se conserva universalmente en todos los dominios de la vida. Basándose en la similitud de sus secuencias de aminoácidos, se pueden encontrar homólogos de varias proteínas en múltiples dominios de la vida, lo que indica que evolucionaron hace mucho tiempo y desde entonces se han separado de las proteínas ancestrales comunes.

Los miembros de la familia de la recombinasa RecA se encuentran en casi todos los organismos con RecA en bacterias, Rad51 y DMC1 en eucariotas, RadA en arqueas y UvsX en fagos T4 .

Las proteínas de unión monocatenarias relacionadas que son importantes para la recombinación homóloga y muchos otros procesos también se encuentran en todos los dominios de la vida.

Rad54, Mre11 , Rad50 y varias otras proteínas también se encuentran tanto en arqueas como en eucariotas.

La familia de la recombinasa RecA

Se cree que las proteínas de la familia de proteínas de la recombinasa RecA descienden de una recombinasa ancestral común. La familia de recombinasas RecA contiene la proteína RecA de bacterias , las proteínas Rad51 y Dmc1 de eucariotas y RadA de arqueas y las proteínas paralog de recombinasa. Los estudios que modelan las relaciones evolutivas entre las proteínas Rad51, Dmc1 y RadA indican que son monofiléticas o que comparten un ancestro molecular común. Dentro de esta familia de proteínas, Rad51 y Dmc1 se agrupan en un clado separado de RadA. Una de las razones para agrupar estas tres proteínas es que todas poseen un motivo hélice-giro-hélice modificado , que ayuda a las proteínas a unirse al ADN, hacia sus extremos N-terminales . Se ha propuesto un antiguo evento de duplicación de genes de un gen RecA eucariota y una mutación posterior como un origen probable de los genes RAD51 y DMC1 modernos.

Las proteínas generalmente comparten una región largamente conservada conocida como dominio RecA / Rad51. Dentro de este dominio de la proteína son dos motivos de secuencia , Walker Un motivo y Walker B motivo . Los motivos Walker A y B permiten a los miembros de la familia de proteínas RecA / Rad51 participar en la unión de ATP y la hidrólisis de ATP .

Proteínas específicas de la meiosis

El descubrimiento de Dmc1 en varias especies de Giardia , uno de los primeros protistas en divergir como eucariota, sugiere que la recombinación homóloga meiótica —y por lo tanto la meiosis misma— surgió muy temprano en la evolución eucariota. Además de la investigación sobre Dmc1, los estudios sobre la proteína Spo11 han proporcionado información sobre los orígenes de la recombinación meiótica. La Spo11, una topoisomerasa de tipo II , puede iniciar la recombinación homóloga en la meiosis haciendo roturas de doble hebra específicas en el ADN. Los árboles filogenéticos basados ​​en la secuencia de genes similares a SPO11 en animales, hongos, plantas, protistas y arqueas han llevado a los científicos a creer que la versión Spo11 actualmente en eucariotas surgió en el último ancestro común de eucariotas y arqueas.

Aplicaciones tecnológicas

Orientación genética

Un ratón con una bata blanca manchada de marrón se muestra a la derecha, con dos ratones marrones más pequeños a la izquierda inmediata.
Figura 11. Como embrión en desarrollo, a este ratón quimérico se le introdujo el gen del color de la capa de agutí en su ADN mediante la selección de genes. Su descendencia es homocigótica para el gen agouti.

Muchos métodos para introducir secuencias de ADN en organismos para crear ADN recombinante y organismos modificados genéticamente utilizan el proceso de recombinación homóloga. También llamado orientación genética , el método es especialmente común en la genética de levaduras y ratones . El método de selección de genes en ratones knockout utiliza células madre embrionarias de ratón para suministrar material genético artificial (principalmente de interés terapéutico), que reprime el gen objetivo del ratón mediante el principio de recombinación homóloga. Por tanto, el ratón actúa como un modelo de trabajo para comprender los efectos de un gen específico de mamífero. En reconocimiento a su descubrimiento de cómo se puede utilizar la recombinación homóloga para introducir modificaciones genéticas en ratones a través de células madre embrionarias, Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 .

Los avances en las tecnologías de selección de genes que secuestran la mecánica de recombinación homóloga de las células están conduciendo ahora al desarrollo de una nueva ola de modelos de enfermedades humanas isogénicas más precisas . Se cree que estos modelos de células humanas diseñadas reflejan con mayor precisión la genética de las enfermedades humanas que sus predecesores de modelos de ratón. Esto se debe en gran parte a que se introducen mutaciones de interés en genes endógenos, tal como ocurren en los pacientes reales, y a que se basan en genomas humanos en lugar de genomas de rata. Además, ciertas tecnologías permiten el knock-in de una mutación particular en lugar de simplemente knock-outs asociados con tecnologías más antiguas de selección de genes.

Ingeniería de proteínas

La ingeniería de proteínas con recombinación homóloga desarrolla proteínas quiméricas intercambiando fragmentos entre dos proteínas parentales. Estas técnicas aprovechan el hecho de que la recombinación puede introducir un alto grado de diversidad de secuencia al tiempo que conserva la capacidad de una proteína para plegarse en su estructura terciaria o forma tridimensional. Esto contrasta con otras técnicas de ingeniería de proteínas, como la mutagénesis puntual aleatoria , en la que la probabilidad de mantener la función de la proteína disminuye exponencialmente al aumentar las sustituciones de aminoácidos . Las quimeras producidas por técnicas de recombinación son capaces de mantener su capacidad de plegarse porque sus fragmentos parentales intercambiados se conservan estructural y evolutivamente. Estos "bloques de construcción" recombinables conservan interacciones estructuralmente importantes como puntos de contacto físico entre diferentes aminoácidos en la estructura de la proteína. Se pueden utilizar métodos computacionales como SCHEMA y análisis de acoplamiento estadístico para identificar subunidades estructurales adecuadas para la recombinación.

Se han utilizado técnicas que se basan en la recombinación homóloga para diseñar nuevas proteínas. En un estudio publicado en 2007, los investigadores pudieron crear quimeras de dos enzimas involucradas en la biosíntesis de isoprenoides , una clase diversa de compuestos que incluyen hormonas , pigmentos visuales y ciertas feromonas . Las proteínas quiméricas adquirieron la capacidad de catalizar una reacción esencial en la biosíntesis de isoprenoides, una de las vías de biosíntesis más diversas que se encuentran en la naturaleza, que estaba ausente en las proteínas originales. La ingeniería de proteínas a través de la recombinación también ha producido enzimas quiméricas con nueva función en miembros de un grupo de proteínas conocido como la familia del citocromo P450 , que en humanos está involucrado en la desintoxicación de compuestos extraños como medicamentos, aditivos alimentarios y conservantes.

Terapia del cáncer

Las células cancerosas con capacidad de recombinación homóloga (HRP) son capaces de reparar el daño del ADN, que es causado por la quimioterapia como el cisplatino. Por tanto, los cánceres de HRP son difíciles de tratar. Los estudios sugieren que la recombinación homóloga puede dirigirse a través de la inhibición de c-Abl. Las células cancerosas con mutaciones BRCA tienen deficiencias en la recombinación homóloga, y se han desarrollado y utilizado con éxito en ensayos clínicos fármacos para aprovechar esas deficiencias. Olaparib , un inhibidor de PARP1, redujo o detuvo el crecimiento de tumores de cáncer de mama , ovario y próstata causados ​​por mutaciones en los genes BRCA1 o BRCA2 , que son necesarios para la HR. Cuando BRCA1 o BRCA2 están ausentes, otros tipos de mecanismos de reparación del ADN deben compensar la deficiencia de HR, como la reparación por escisión de base (BER) para horquillas de replicación estancadas o la unión de extremos no homólogos (NHEJ) para roturas de doble hebra. Al inhibir la BER en una célula deficiente en HR, olaparib aplica el concepto de letalidad sintética para atacar específicamente las células cancerosas. Si bien los inhibidores de PARP1 representan un enfoque novedoso para la terapia del cáncer, los investigadores han advertido que pueden resultar insuficientes para tratar los cánceres metastásicos en etapa tardía . Las células cancerosas pueden volverse resistentes a un inhibidor de PARP1 si sufren deleciones de mutaciones en BRCA2, lo que socava la letalidad sintética del fármaco al restaurar la capacidad de las células cancerosas para reparar el ADN mediante HR.

Ver también

Referencias

enlaces externos