Agregometría de electrodos múltiples - Multiple electrode aggregometry
| Agregometría de múltiples electrodos | |
|---|---|
 El analizador multiplato
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| Objetivo | Determinación de la función plaquetaria |
| Prueba de | Sangre pura |
La agregometría de múltiples electrodos multiplatos (MEA) es una prueba de la función plaquetaria en sangre total . La prueba se puede utilizar para diagnosticar trastornos plaquetarios, controlar la terapia antiplaquetaria y también se investiga como un predictor potencial de los requisitos de transfusión y el riesgo de hemorragia en la cirugía cardíaca.
Instrumento
El analizador Multiplate MEA (Roche Diagnostics International Ltd) tiene 5 canales para la medición simultánea de varias muestras o agonistas . El instrumento detecta cambios en la impedancia eléctrica cuando las plaquetas se agregan sobre electrodos metálicos en la cubeta de prueba . Cada cubeta contiene dos pares de electrodos sensores, cada uno de los cuales mide el cambio de impedancia. Los sensores duplicados sirven como un control de calidad integrado, y el análisis se acepta si el coeficiente de correlación de las mediciones es superior a 0,98. También se calcula la diferencia de cada curva con respecto a la curva media y se acepta una diferencia inferior al 20%. Las cubetas de prueba también contienen una barra de agitación magnética recubierta de teflón . El aumento de impedancia a medida que se produce la agregación se transforma en unidades de agregación (AU) y se representa en función del tiempo en la pantalla del ordenador.
Muestra
El fabricante recomienda el uso de hirudina como anticoagulante para las muestras a analizar, pero los estudios han demostrado que la heparina es una buena alternativa. Se necesitan 300 µL de sangre para cada análisis y se diluye con la misma cantidad de solución salina . Después de pipetear sangre y solución salina en la cubeta, la prueba se incuba durante tres minutos antes de agregar el agonista elegido. A continuación, se inicia la prueba y se registra la agregación plaquetaria a intervalos de aproximadamente 0,5 segundos durante seis minutos. Se calculan tres parámetros: agregación , velocidad y área bajo la curva (AUC). La agregación (en AU) es la altura máxima de la curva de agregación y la velocidad (en AU / min) es la pendiente máxima de la curva. AUC es el parámetro más importante . Se registra en Unidades (U) y se ve afectado tanto por la altura como por la pendiente de la curva de agregación, y es la mejor medida general de la actividad plaquetaria.
Ensayos / reactivos multiplaca
| ADP | Epinefrina | Colágeno | Ristocetina | |
|---|---|---|---|---|
| Defecto del receptor P2Y | Disminuido | Normal | Normal | Normal |
| Defecto del receptor adrenérgico | Normal | Disminuido | Normal | Normal |
| Defecto del receptor de colágeno | Normal | Normal | Disminuido o ausente | Normal |
| Normal | Normal | Normal | Disminuido o ausente | |
| Disminuido | Disminuido | Disminuido | Normal o disminuido |
ADPtest
El difosfato de adenosina (ADP) es un agonista plaquetario. Cuando se agrega a la sangre entera diluida con solución salina en la cubeta de prueba, estimula los receptores de ADP en las plaquetas, activando las plaquetas. La activación de las plaquetas conduce al cambio de forma y la desgranulación, y el contenido liberado de los gránulos activa aún más las plaquetas. La activación también induce un cambio conformacional en el receptor de la glicoproteína IIb / IIIa (GPIIb / IIIa), lo que le confiere una alta afinidad por el fibrinógeno . La unión del fibrinógeno a los receptores GPIIb / IIIa conduce a puentes plaquetarios a plaquetas y da como resultado la agregación plaquetaria. Los fármacos antiplaquetarios como clopidogrel y prasugrel inhiben irreversiblemente el receptor P2Y12 de ADP , lo que conduce a una disminución de la agregación plaquetaria inducida por ADP. Los fármacos que inhiben el receptor GPIIb / IIIa, por ejemplo, eptifibatida , también pueden reducir o eliminar la respuesta plaquetaria inducida por ADP.
ASPItest
En la prueba ASPI se agrega ácido araquidónico a la muestra de sangre diluida con solución salina. El ácido araquidónico se convierte en prostaglandina H2 (PGH2) por la ciclooxigenasa-1 (COX1), y la PGH2 luego se convierte en tromboxano A2 (TXA2) por la tromboxano sintasa . TXA2 aumenta la agregación plaquetaria, promueve la desgranulación y estimula la activación plaquetaria. La inhibición de COX1, como ocurre con el ácido acetilsalicílico , y la inhibición o ausencia del receptor GPIIb / IIIa, como se observa en la trombastenia de Glanzmann , reducirá la agregación plaquetaria en respuesta al ácido araquidónico.
COLtest
Se agrega colágeno a la mezcla de muestra y solución salina y se une a los receptores de colágeno en las plaquetas. Esto conduce a la liberación de ácido araquidónico, que se convierte en el potente activador plaquetario TXA2. COLtest es sensible a la inhibición de COX1 y GPIIb / IIIa y a la trombastenia de Glanzmann .
RISTOtest
La ristocetina forma complejos con el factor von Willebrand (vWF) que se unen a los receptores de la glucoproteína Ib (GP1b) en las plaquetas, provocando la activación y agregación plaquetarias. La agregación reducida o ausente en respuesta a la ristocetina puede deberse a una falta o reducción del vWF, como se observa en la enfermedad de von Willebrand (EvW), o ausencia o reducción en el número de receptores GP1b, como en el síndrome de Bernard-Soulier (BSS). RISTOtest se puede realizar en dos concentraciones; RISTOhigh y RISTOlow. En RISTOhigh, se aplica una concentración de ristocetina de 0,77 mg / ml. Esto normalmente induce una fuerte agregación plaquetaria, y las condiciones antes mencionadas de EvW y BSS pueden causar una agregación baja o ausente. En RISTOlow, la concentración de ristocetina es de solo 0,2 mg / ml, y a un nivel que normalmente no induce una fuerte respuesta de agregación. Esta prueba puede detectar si el vWF muestra una tendencia más fuerte de lo normal a agregar plaquetas, lo que se puede ver en un subtipo de EvW llamado vWDIIb.
TRAMPA
El péptido 6 activador del receptor de trombina (TRAP-6) activa las plaquetas a través del receptor 1 activado por proteasa del receptor de trombina (PAR-1). La unión de TRAP-6 a PAR-1 provoca un cambio conformacional en los receptores GPIIb / IIIa de las plaquetas, lo que les confiere una alta afinidad por el fibrinógeno. Luego, el fibrinógeno se une a los receptores, reticulando varias plaquetas y provocando agregación. La agregación en TRAPtest puede estar reducida o ausente en la trombastenia de Glanzmann , donde los receptores GPIIb / IIIa son escasos o ausentes, o si el paciente está tomando un antagonista GPIIb / IIIa . Traptest tiene una sensibilidad mínima para la inhibición de los receptores COX1 y ADP.
Reactivo ASA
Agregar reactivo ASA ( ácido acetilsalicílico ) a una muestra de sangre reduce las respuestas de agregación en ASPItest y COLtest. El ASA inhibe irreversiblemente la COX1 en las plaquetas, inhibiendo así la producción de TXA2. El reactivo ASA se utiliza como control de calidad en las pruebas de función plaquetaria con Multiplate, lo que permite evaluar las respuestas plaquetarias anormales en ASPItest y COLtest.
Reactivo antagonista GPIIb / IIIa
Este reactivo se utiliza como control de calidad en las pruebas de función plaquetaria Multiplate. El antagonista de GPIIb / IIIa bloquea la unión del fibrinógeno a los receptores de GPIIb / IIIa, evitando la formación de enlaces plaquetas-fibrinógeno y dando como resultado una agregación plaquetaria significativamente reducida en respuesta a todos los agonistas. El reactivo antagonista se utiliza junto con la prueba TRAP y permite la evaluación de un control positivo.
Reactivo de prostaglandina E1
La prostaglandina E1 (PGE1) es un inhibidor de plaquetas que provoca un aumento del monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en las plaquetas al estimular la actividad de la adenilil ciclasa . El cAMP es una molécula de señalización intracelular , y el aumento de cAMP inhibe la movilización de calcio y la agregación plaquetaria inducida por la activación del receptor P2Y1 de ADP. La activación del receptor P2Y1 inicia la agregación plaquetaria en respuesta al ADP. El receptor P2Y1 es necesario para la activación plaquetaria inducida por ADP, pero no es suficiente para una agregación plaquetaria completa en respuesta a ADP. El cAMP inhibe la agregación plaquetaria y la disminución de las cantidades de cAMP en las plaquetas conduce a la agregación plaquetaria. El reactivo PGE1 se utiliza junto con la prueba ADP para dos propósitos: la evaluación de ADP de alta sensibilidad (HS) y de controles positivos de la prueba ADP. Cuando se añade una pequeña cantidad de PGE1 (20 µl) al ADPtest, induce una inhibición moderada de la agregación en muestras normales, pero aumenta en gran medida la sensibilidad de las plaquetas a la inhibición por clopidogrel. Es por eso que la prueba modificada se llama "Alta sensibilidad". La adición de 50 µl de PGE1 al ADPtest conduce a una fuerte inhibición de la agregación inducida por ADP y se utiliza para evaluar los controles positivos del ADPtest.