Producción de proteínas - Protein production
La producción de proteínas es el proceso biotecnológico de generar una proteína específica . Por lo general, se logra mediante la manipulación de la expresión génica en un organismo de manera que exprese grandes cantidades de un gen recombinante . Esto incluye la transcripción del DNA recombinante para mensajero ARN ( mRNA ), el traducción de ARNm en polipéptido cadenas, que son en última instancia, doblado en funcionales proteínas y pueden ser dirigidos a subcelular específica o localizaciones extracelulares.
Los sistemas de producción de proteínas (en la jerga de laboratorio también denominados "sistemas de expresión") se utilizan en las ciencias de la vida , la biotecnología y la medicina . La investigación en biología molecular utiliza numerosas proteínas y enzimas, muchas de las cuales proceden de sistemas de expresión; particularmente ADN polimerasa para PCR , transcriptasa inversa para análisis de ARN, endonucleasas de restricción para clonación y para producir proteínas que se seleccionan en el descubrimiento de fármacos como dianas biológicas o como fármacos potenciales ellos mismos. También existen aplicaciones importantes para los sistemas de expresión en la fermentación industrial , en particular la producción de biofarmacéuticos como la insulina humana para tratar la diabetes y para fabricar enzimas .
Sistemas de producción de proteínas
Los sistemas de producción de proteínas comúnmente utilizados incluyen los derivados de bacterias , levaduras , baculovirus / insectos , células de mamíferos y, más recientemente, hongos filamentosos como Myceliophthora thermophila . Cuando se producen productos biofarmacéuticos con uno de estos sistemas, las impurezas relacionadas con el proceso denominadas proteínas de la célula huésped también llegan al producto final en cantidades mínimas.
Sistemas basados en células
Los sistemas de expresión más antiguos y más utilizados están basados en células y pueden definirse como la " combinación de un vector de expresión , su ADN clonado y el huésped del vector que proporciona un contexto para permitir la función de genes extraños en una célula huésped, que es decir, producir proteínas a un alto nivel ". La sobreexpresión es un nivel anormal y excesivamente alto de expresión génica que produce un fenotipo pronunciado relacionado con el gen .
Hay muchas formas de introducir ADN extraño en una célula para su expresión, y se pueden usar muchas células hospedadoras diferentes para la expresión; cada sistema de expresión tiene distintas ventajas y desventajas. Los sistemas de expresión normalmente se denominan por el anfitrión y la fuente de ADN o el mecanismo de entrega del material genético. Por ejemplo, los huéspedes comunes son bacterias (como E. coli , B. subtilis ), levaduras (como S. cerevisiae ) o líneas celulares eucariotas . Las fuentes de ADN y los mecanismos de administración comunes son virus (como baculovirus , retrovirus , adenovirus ), plásmidos , cromosomas artificiales y bacteriófagos (como lambda ). El mejor sistema de expresión depende del gen implicado, por ejemplo, a menudo se prefiere Saccharomyces cerevisiae para proteínas que requieren una modificación postraduccional significativa . Las líneas celulares de insectos o mamíferos se utilizan cuando se requiere un corte y empalme de ARNm similar al humano. No obstante, la expresión bacteriana tiene la ventaja de producir fácilmente grandes cantidades de proteína, que se requiere para la cristalografía de rayos X o los experimentos de resonancia magnética nuclear para la determinación de la estructura.
Debido a que las bacterias son procariotas , no están equipadas con la maquinaria enzimática completa para lograr las modificaciones postraduccionales requeridas o el plegamiento molecular. Por tanto, las proteínas eucariotas multidominio expresadas en bacterias a menudo no son funcionales. Además, muchas proteínas se vuelven insolubles como cuerpos de inclusión que son difíciles de recuperar sin desnaturalizantes agresivos y el posterior replegamiento de proteínas engorroso.
Para abordar estas preocupaciones, se desarrollaron sistemas de expresiones que utilizan múltiples células eucariotas para aplicaciones que requieren que las proteínas se amolden como en organismos eucariotas o más cerca de ellos: células de plantas (es decir, tabaco), de insectos o mamíferos (es decir, bovinos) se transfectan con genes y cultivados en suspensión e incluso como tejidos u organismos completos, para producir proteínas completamente plegadas. Sin embargo, los sistemas de expresión in vivo de mamíferos tienen un bajo rendimiento y otras limitaciones (que consume mucho tiempo, toxicidad para las células huésped, ..). Para combinar el alto rendimiento / productividad y las características proteicas escalables de bacterias y levaduras, y las características epigenéticas avanzadas de los sistemas de plantas, insectos y mamíferos, se desarrollan otros sistemas de producción de proteínas utilizando eucariotas unicelulares (es decir , células de ' Leishmania ' no patógenas ).
Sistemas bacterianos
Escherichia coli
E. coli es uno de los hospedadores de expresión más utilizados y el ADN normalmente se introduce en unvector de expresión plasmídico . Las técnicas para la sobreexpresión en E. coli están bien desarrolladas y funcionan aumentando el número de copias del gen o aumentando la fuerza de unión de la región promotora para ayudar a la transcripción.
Por ejemplo, una secuencia de ADN para una proteína de interés podría clonarse o subclonarse en un plásmido de alto número de copias que contiene el promotor lac (a menudo LacUV5 ), que luego se transforma en la bacteria E. coli . La adición de IPTG (un análogo de lactosa ) activa el promotor lac y hace que las bacterias expresen la proteína de interés.
Las cepas de E. coli BL21 y BL21 (DE3) son dos cepas comúnmente utilizadas para la producción de proteínas. Como miembros del linaje B, carecen de proteasas lon y OmpT , lo que protege las proteínas producidas de la degradación. El profago DE3 que se encuentra en BL21 (DE3) proporciona la ARN polimerasa de T7 (impulsada por el promotor LacUV5), lo que permite utilizar vectores con el promotor T7 en su lugar.
Corynebacterium
Las especies no patógenas de Corynebacterium gram-positivas se utilizan para la producción comercial de varios aminoácidos. La especie C. glutamicum se usa ampliamente para producir glutamato y lisina , componentes de alimentos humanos, animales y productos farmacéuticos.
La expresión del factor de crecimiento epidérmico humano funcionalmente activo se ha realizado en C. glutamicum , demostrando así un potencial para la producción a escala industrial de proteínas humanas. Las proteínas expresadas pueden dirigirse a la secreción a través de la vía secretora general (Sec) o la vía de translocación de arginina gemela (Tat).
A diferencia de las bacterias gramnegativas , la Corynebacterium grampositiva carece de lipopolisacáridos que funcionan como endotoxinas antigénicas en los seres humanos.
Pseudomonas fluorescens
Las bacterias gramnegativas y no patógenas, Pseudomonas fluorescens , se utilizan para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes; comúnmente para el desarrollo de bioterapéuticos y vacunas. P. fluorescens es un organismo metabólicamente versátil que permite un cribado de alto rendimiento y un rápido desarrollo de proteínas complejas. P. fluorescens es más conocido por su capacidad para producir de forma rápida y satisfactoria títulos elevados de proteína soluble activa.
Sistemas eucariotas
Levaduras
Los sistemas de expresión que utilizan S. cerevisiae o Pichia pastoris permiten la producción estable y duradera de proteínas que se procesan de forma similar a las células de mamífero, con alto rendimiento, en medios de proteínas químicamente definidos.
Hongos filamentosos
Los hongos filamentosos, especialmente Aspergillus y Trichoderma , pero también más recientemente Myceliophthora thermophila C1, se han desarrollado en plataformas de expresión para la detección y producción de diversas enzimas industriales . El sistema de expresión C1 muestra una morfología de baja viscosidad en cultivo sumergido, lo que permite el uso de medios complejos de crecimiento y producción.
Células infectadas con baculovirus
Las células de insectos infectadas con baculovirus ( cepas Sf9 , Sf21 , High Five ) o las células de mamíferos ( HeLa , HEK 293 ) permiten la producción de proteínas glicosiladas o de membrana que no pueden producirse utilizando sistemas fúngicos o bacterianos. Es útil para la producción de proteínas en gran cantidad. Los genes no se expresan continuamente porque las células huésped infectadas eventualmente se lisan y mueren durante cada ciclo de infección.
Expresión de células de insectos no líticas
La expresión de células de insectos no líticas es una alternativa al sistema de expresión de baculovirus líticos. En la expresión no lítica, los vectores se transfectan de forma transitoria o estable en el ADN cromosómico de las células de insecto para la expresión génica posterior. A esto le sigue la selección y cribado de clones recombinantes. El sistema no lítico se ha utilizado para proporcionar un mayor rendimiento de proteínas y una expresión más rápida de genes recombinantes en comparación con la expresión de células infectadas por baculovirus. Las líneas celulares utilizadas para este sistema incluyen: Sf9 , Sf21 de células de Spodoptera frugiperda , Hi-5 de células de Trichoplusia ni y células de Schneider 2 y células de Schneider 3 de células de Drosophila melanogaster . Con este sistema, las células no se lisan y se pueden utilizar varios modos de cultivo. Además, las series de producción de proteínas son reproducibles. Este sistema da un producto homogéneo. Un inconveniente de este sistema es el requisito de un paso de cribado adicional para seleccionar clones viables .
Excavata
Los sistemas de expresión de Leishmania tarentolae (no puede infectar a los mamíferos) permiten la producción estable y duradera de proteínas con alto rendimiento, en medios químicamente definidos. Las proteínas producidas exhiben modificaciones postraduccionales completamente eucariotas, incluida la glicosilación y la formación de enlaces disulfuro.
Sistemas de mamíferos
Los sistemas de expresión de mamíferos más comunes son las células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón embrionario humano (HEK).
- Célula de ovario de hámster chino
- Mieloma linfoblástico de ratón (p. Ej., Células NS0)
- Completamente humano
- Células de riñón embrionario humano ( HEK-293 )
- Células retinianas embrionarias humanas (Crucell's Per.C6)
- Células de amniocitos humanos (glicotopo y CEVEC)
Sistemas sin células
La producción de proteínas sin células se realiza in vitro utilizando ARN polimerasa purificada, ribosomas, ARNt y ribonucleótidos. Estos reactivos pueden producirse mediante extracción de células o de un sistema de expresión basado en células. Debido a los bajos niveles de expresión y al alto costo de los sistemas libres de células, los sistemas basados en células se utilizan más ampliamente.
Ver también
- Cellosaurus , una base de datos de líneas celulares
- La expresion genica
- Proteína unicelular
- Purificación de proteínas
- Fermentación de precisión
- Proteína de la célula huésped
- Lista de proteínas recombinantes
Referencias
Otras lecturas
- Higgins SJ, Hames BD (1999). Expresión de proteínas: un enfoque práctico . Prensa de la Universidad de Oxford. ISBN 978-0-19-963623-5.
- Baneyx, François (2004). Tecnologías de expresión de proteínas: estado actual y tendencias futuras . Garland Science. ISBN 978-0-9545232-5-1.
enlaces externos
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Recursos de la biblioteca sobre la producción de proteínas |