Subclonación - Subcloning
En biología molecular , la subclonación es una técnica que se usa para mover una secuencia de ADN particular desde un vector parental a un vector de destino .
La subclonación no debe confundirse con la clonación molecular , una técnica relacionada.
Procedimiento
Las enzimas de restricción se utilizan para eliminar el gen de interés (el inserto ) del padre. El inserto se purifica para aislarlo de otras moléculas de ADN. Un método de purificación común es el aislamiento en gel . El número de copias del gen se amplifica luego mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Simultáneamente, se utilizan las mismas enzimas de restricción para digerir (cortar) el destino. La idea detrás del uso de las mismas enzimas de restricción es crear extremos pegajosos complementarios , lo que facilitará la ligadura más adelante. También se agrega una fosfatasa , comúnmente fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), para prevenir la autoligación del vector de destino. El vector de destino digerido se aísla / purifica.
A continuación, el inserto y el vector de destino se mezclan con ADN ligasa. Una relación molar típica de genes de inserción a vectores de destino es 3: 1; al aumentar la concentración del inserto, la autoligadura se reduce aún más. Después de dejar reposar la mezcla de reacción durante un tiempo determinado a una temperatura específica (dependiendo del tamaño de las hebras que se ligan; para obtener más información, consulte ADN ligasa ), el inserto debe incorporarse con éxito en el plásmido de destino .
Amplificación del producto plásmido
El plásmido a menudo se transforma en una bacteria como E. coli . Idealmente, cuando la bacteria se divide, el plásmido también debería replicarse. En el mejor de los casos, cada célula bacteriana debería tener varias copias del plásmido. Después de que haya crecido un buen número de colonias bacterianas, se pueden minipreparar para recolectar el ADN plasmídico.
Selección
Para asegurar el crecimiento de solo bacterias transformadas (que portan los plásmidos deseados para ser recolectados), se usa un gen marcador en el vector de destino para la selección . Los genes marcadores típicos son para la resistencia a los antibióticos o la biosíntesis de nutrientes . Entonces, por ejemplo, el "gen marcador" podría ser para la resistencia al antibiótico ampicilina. Si las bacterias que se suponía que captaban el plásmido deseado habían captado el gen deseado, también contendrían el "gen marcador". Ahora, las bacterias que recogieron el plásmido podrían crecer en ampicilina, mientras que las bacterias que no recogieron el plásmido deseado aún serían vulnerables a la destrucción por la ampicilina. Por lo tanto, las bacterias transformadas con éxito serían "seleccionadas".
Caso de ejemplo: subclonación de plásmidos bacterianos
En este ejemplo, se subclonará un gen de una biblioteca de genes de mamíferos en un plásmido bacteriano (plataforma de destino). El plásmido bacteriano es un fragmento de ADN circular que contiene elementos reguladores que permiten que las bacterias produzcan un producto génico ( expresión génica ) si se coloca en el lugar correcto del plásmido. El sitio de producción está flanqueado por dos sitios de corte de enzimas de restricción "A" y "B" con extremos pegajosos incompatibles.
El ADN de los mamíferos no viene con estos sitios de restricción, por lo que se incorporan mediante PCR de extensión superpuesta . Los cebadores están diseñados para colocar los sitios de restricción con cuidado, de modo que la codificación de la proteína esté dentro del marco y se implante un mínimo de aminoácidos adicionales a cada lado de la proteína.
Tanto el producto de la PCR que contiene el gen de mamífero con los nuevos sitios de restricción como el plásmido de destino se someten a digestión de restricción, y los productos de la digestión se purifican mediante electroforesis en gel .
Los productos de digestión, que ahora contienen extremos pegajosos compatibles entre sí (pero extremos pegajosos incompatibles con ellos mismos) se someten a ligación, creando un nuevo plásmido que contiene los elementos de fondo del plásmido original con un inserto diferente.
El plásmido se transforma en bacterias y la identidad del inserto se confirma mediante secuenciación de ADN .