Experimento de Nirenberg y Leder - Nirenberg and Leder experiment
El experimento de Nirenberg y Leder fue un experimento científico realizado en 1964 por Marshall W. Nirenberg y Philip Leder . El experimento esclareció la naturaleza triplete del código genético y permitió descifrar los codones ambiguos restantes en el código genético .
En este experimento, utilizando un ensayo de unión a ribosomas llamado ensayo de unión a triplete , se pasaron varias combinaciones de ARNm a través de un filtro que contenía ribosomas. Los tripletes únicos promovieron la unión de ARNt específicos al ribosoma. Al asociar el ARNt con su aminoácido específico , fue posible determinar la secuencia de ARNm del triplete que codificaba cada aminoácido.
Fondo
Oswald Avery descubrió que la sustancia responsable de producir un cambio hereditario en las bacterias que causan la enfermedad no era ni una proteína ni un lípido, sino el ácido desoxirribonucleico ( ADN ). Él y sus colegas Colin MacLeod y Maclyn McCarty sugirieron que el ADN era responsable de la transferencia de información genética. Más tarde, Erwin Chargaff descubrió que la composición del ADN difiere de una especie a otra. Estos experimentos ayudaron a allanar el camino para el descubrimiento de la estructura del ADN. En 1953, con la ayuda de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin ‘s cristalografía de rayos X , James Watson y Francis Crick propuso ADN está estructurada como una doble hélice .
En la década de 1960, uno de los principales misterios del ADN que los científicos necesitaban descubrir era en la traducción cuántas bases habría en cada palabra de código o codón . Los científicos sabían que había un total de cuatro bases ( guanina , citosina , adenina y timina ). También sabían que eran 20 aminoácidos conocidos . George Gamow sugirió que el código genético estaba formado por tres nucleótidos por aminoácido. Razonó que debido a que hay 20 aminoácidos y solo cuatro bases, las unidades de codificación no pueden ser simples (4 combinaciones) o pares (solo 16 combinaciones). Más bien, pensó que los trillizos (64 combinaciones posibles) eran la unidad codificadora del código genético. Sin embargo, propuso que los trillizos se superpusieran y no fueran degenerados .
Seymour Benzer, a finales de la década de 1950, había desarrollado un ensayo utilizando mutaciones de fagos que proporcionó el primer mapa detallado estructurado linealmente de una región genética. Crick sintió que podía usar la mutagénesis y la recombinación genética del fago para delinear aún más la naturaleza del código genético. En Crick, Brenner et al. Experimento , utilizando estos fagos, se confirmó la naturaleza triplete del código genético. Utilizaron mutaciones de desplazamiento de marco y un proceso llamado reversiones , para agregar y eliminar varios números de nucleótidos. Cuando se añadió o eliminó un triplete de nucleótidos de la secuencia de ADN, la proteína codificada se vio mínimamente afectada. Por lo tanto, llegaron a la conclusión de que el código genético es un código triplete porque no provocó un cambio de marco en el marco de lectura. Concluyeron correctamente que el código está degenerado, que los tripletes no se superponen y que cada secuencia de nucleótidos se lee desde un punto de partida específico.
Trabajo experimental
El primer codón de aminoácido (UUU que codifica la fenilalanina) fue descifrado por Nirenberg y su postdoctorado Heinrich Matthaei (ver el experimento de Nirenberg y Matthaei ) usando ARN sintético largo. Sin embargo, cuando se fabrican ARN similares que contienen más de una base de ARN, el orden de las bases es aleatorio. Por ejemplo, se podría fabricar un ARN largo que tuviera una relación de C a U de 2: 1 y, por lo tanto, contendría codones CCU, CUC, UCC a alta frecuencia. Cuando se traduce por ribosomas, esto produciría una proteína que contiene los aminoácidos serina, leucina y fenilalanina; pero no fue posible decir qué codón coincidía con qué aminoácido.
En cambio, el grupo de Nirenberg recurrió a ARN sintéticos muy cortos. Descubrieron que el trinucleótido UUU (que es el codón de la fenilalanina) podía causar una asociación específica de ARNt cargado de fenilalanina con los ribosomas. Esta asociación podría detectarse pasando la mezcla a través de un filtro de nitrocelulosa: el filtro captura los ribosomas pero no el ARNt libre; sin embargo, si el ARNt estuviera asociado con el ribosoma, también sería capturado (junto con la fenilalanina radiactiva unida al ARNt). De manera similar, encontraron que los trinucleótidos AAA o CCC causaron la asociación ribosómica de lisina-tRNA o prolina-tRNA, respectivamente.
Así que un plan experimental era claro: sintetizar las 64 combinaciones diferentes de trinucleótidos y usar el ensayo de filtro con ARNt cargados con los 20 aminoácidos, para ver qué aminoácido asociado con qué trinucleótido. Sin embargo, la obtención de trinucleótidos puros con secuencias de bases mixtas, por ejemplo GUU, fue un desafío abrumador. Los estudios pioneros de Leder utilizaron trinucleótidos elaborados al descomponer ARN poli-GU aleatorio largo con nucleasa y purificando trinucleótidos específicos mediante cromatografía en papel : determinó que GUU, UGU y UUG codificaban los aminoácidos fenilalanina, cisteína y valina, respectivamente. Posteriormente, el grupo de Nirenberg construyó trinucleótidos utilizando ADN polimerasas acopladas con nucleótidos y ARN polimerasas para crear el ARN poli-GU aleatorio largo y replicar artificialmente los trinucleótidos purificados. Una vez que se produjeron concentraciones suficientemente altas de ARNm, se logró la degradación y reformación de los productos de la polimerasa mediante procesos enzimáticos. Por ejemplo, AGU podría prepararse a partir de AG y U con polinucleótido fosforilasa ; La UAG se podría preparar a partir de AG y U con ribonucleasa A en una alta concentración de metanol. El postdoctorado de Nirenberg, Merton Bernfield, utilizó estas técnicas para determinar que UUU y UUC codifican fenilalanina, UCU y UCC codifican serina, y CCC y CCU codifican prolina, destacando un patrón en la forma en que el código genético codifica de forma redundante los aminoácidos. Muchos otros en el laboratorio de Nirenberg y en los NIH contribuyeron al desciframiento completo del código genético.
Recepción y legado
En el Simposio de Cold Spring Harbor de 1966, entre Nirenberg y Khorana, el código genético estaba casi completamente descodificado. Nirenberg recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1968 . Compartió el premio con Har Gobind Khorana de la Universidad de Wisconsin y Robert W. Holley del Instituto Salk. Trabajando de forma independiente, Khorana había dominado la síntesis de ácidos nucleicos y Holley había descubierto la estructura química exacta del ARN de transferencia.
El New York Times dijo del trabajo de Nirenberg que "la ciencia de la biología ha alcanzado una nueva frontera", lo que ha llevado a "una revolución mucho mayor en su significado potencial que la bomba atómica o de hidrógeno". La mayoría de la comunidad científica vio estos experimentos como muy importantes y beneficiosos. Sin embargo, hubo algunos que estaban preocupados por la nueva era de la genética molecular . Por ejemplo, Arne Tiselius , premio Nobel de Química de 1948, afirmó que el conocimiento del código genético podría "conducir a métodos de alterar la vida, de crear nuevas enfermedades, de controlar las mentes, de influir en la herencia, incluso quizás en ciertas direcciones deseadas". "
Referencias
- ^ Russell P. (2010). iGenetics: A Molecular Approach, 3ª edición . Pearson / Benjamin Cummings.
- ^ Leavitt, Sarah A. (2004). "Descifrando el código genético: Marshall Nirenberg. La locura de la codificación" . Museo Stetten, Oficina de Historia de los NIH. Archivado desde el original el 9 de febrero de 2020 . Consultado el 5 de octubre de 2009 .
- ^ Yanofsky C. (2007). "Establecimiento de la naturaleza triplete del código genético" (PDF) . Celular . 128 (5): 815–818. doi : 10.1016 / j.cell.2007.02.029 . PMID 17350564 . Consultado el 24 de enero de 2018 .
- ^ Crick FHC; Brenner S .; Barnett L. y Watts-Tobin RJ (1961). "Naturaleza general del código genético de proteínas" (PDF) . Naturaleza . 192 (4809): 1227–1232. Código Bib : 1961Natur.192.1227C . doi : 10.1038 / 1921227a0 . PMID 13882203 . S2CID 4276146 . Consultado el 10 de octubre de 2009 .
- ^ Matthaei, HJ, Jones, OW, Martin, RG y Nirenberg, MW (1962). "Características y composición de las unidades de codificación de ARN" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 48 (4): 666–677. Código Bib : 1962PNAS ... 48..666M . doi : 10.1073 / pnas.48.4.666 . PMC 220831 . PMID 14471390 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Leavitt, Sarah A. (2004). "Descifrando el código genético: Marshall Nirenberg. Instrumentos científicos" . Museo Stetten, Oficina de Historia de los NIH. Archivado desde el original el 9 de febrero de 2020 . Consultado el 5 de octubre de 2009 .
- ^ Judson H. (1996). El octavo día de la creación: creadores de la revolución en biología . Cold Spring Harbor: Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor.
- ↑ a b Philip Leder y Marshall Nirenberg (1964). "Palabras en código de ARN y síntesis de proteínas. El efecto de los trinucleótidos sobre la unión del ARNm a los ribosomas". Ciencia . 145 (3639): 1399–1407. doi : 10.1126 / science.145.3639.1399 . PMID 14172630 . S2CID 7127820 .
- ^ Leder P. y Nirenberg MW (1964). "Palabras en código de ARN y síntesis de proteínas, II. Secuencia de nucleótidos de una palabra en código de ARN de valina" . PNAS . 52 (2): 420–427. doi : 10.1073 / pnas.52.2.420 . PMC 300293 . PMID 14206609 .
- ^ Leder P. y Nirenberg MW (1964). "Palabras en clave de ARN y síntesis de proteínas, III. Sobre la secuencia de nucleótidos de una palabra en clave de ARN de cisteína y leucina" . PNAS . 52 (6): 1521-1529. Código Bibliográfico : 1964PNAS ... 52.1521L . doi : 10.1073 / pnas.52.6.1521 . PMC 300480 . PMID 14243527 .
- ↑ a b Nirenberg, Marshall (2004). "Revisión histórica: descifrar el código genético - una cuenta personal". Tendencias en Ciencias Bioquímicas . 29 (1): 46–54. doi : 10.1016 / j.tibs.2003.11.009 . PMID 14729332 .
- ^ Bernfield MR y Nirenberg MW (1965). "Palabras en código de ARN y síntesis de proteínas. Las secuencias de nucleótidos de múltiples palabras en código para fenilalanina, serina, leucina y prolina". Ciencia . 147 (3657): 479–484. doi : 10.1126 / science.147.3657.479 . PMID 14237203 .
- ^ Cuota, E. (2000). "Perfiles en ciencia: los documentos de Marshall W. Nirenberg. Reacción pública" . Biblioteca Nacional de Medicina. Archivado desde el original el 9 de abril de 2020 . Consultado el 9 de abril de 2020 .
enlaces externos
- Los cuadernos de laboratorio de Philip Leder, de diciembre de 1963 a agosto de 1965 , se pueden encontrar en el Centro de Historia de la Medicina de la Biblioteca Countway de la Facultad de Medicina de Harvard. Los sustitutos digitales también están disponibles a través del catálogo HOLLIS de Harvard.