Análisis de partículas individuales - Single particle analysis
El análisis de partículas individuales es un grupo de técnicas de procesamiento de imágenes computarizadas relacionadas que se utilizan para analizar imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Estos métodos se desarrollaron para mejorar y ampliar la información obtenible a partir de imágenes TEM de muestras de partículas, normalmente proteínas u otras entidades biológicas grandes como los virus . Las imágenes individuales de partículas teñidas o sin teñir son muy ruidosas y muy difíciles de interpretar. La combinación de varias imágenes digitalizadas de partículas similares juntas proporciona una imagen con características más fuertes y más fáciles de interpretar. Una extensión de esta técnica utiliza métodos de partículas individuales para construir una reconstrucción tridimensional de la partícula. Utilizando microscopía crioelectrónica se ha hecho posible generar reconstrucciones con resolución subnanométrica y resolución casi atómica, primero en el caso de virus altamente simétricos, y ahora también en proteínas asimétricas más pequeñas. El análisis de partículas individuales también se puede realizar mediante espectroscopia de masas de plasma acoplado inducido (ICP-MS).
Técnicas
El análisis de partículas individuales se puede realizar tanto en muestras CryoTEM teñidas negativamente como con hielo vítreo . Los métodos de análisis de partículas individuales dependen, en general, de que la muestra sea homogénea, aunque se están desarrollando técnicas para tratar la heterogeneidad conformacional .
Las imágenes (micrografías) se toman con un microscopio electrónico utilizando detectores CCD acoplados a una capa fosforescente (en el pasado, en cambio, se recolectaban en película y se digitalizaban usando escáneres de alta calidad). El procesamiento de imágenes se lleva a cabo mediante programas de software especializados , que a menudo se ejecutan en clústeres de computadoras con múltiples procesadores . Dependiendo de la muestra o de los resultados deseados, se pueden realizar varios pasos de procesamiento bidimensional o tridimensional.
Además, el análisis de partículas individuales también se puede realizar en un modo de partículas individuales utilizando una unidad ICP-MS.
Alineación y clasificación
Las muestras biológicas, y especialmente las muestras incrustadas en hielo vítreo delgado , son altamente sensibles a la radiación, por lo que solo se pueden usar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta dosis baja, así como las variaciones en la mancha de metal utilizada (si se usa), significa que las imágenes tienen un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se observa. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén en registro y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una relación señal / ruido más alta . Como el ruido se distribuye principalmente de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes solo se refuerzan las características constantes. Normalmente, la alineación óptima (una traslación y una rotación en el plano) para mapear una imagen sobre otra se calcula mediante correlación cruzada .
Sin embargo, una micrografía a menudo contiene partículas en múltiples orientaciones y / o conformaciones diferentes, por lo que para obtener promedios de imágenes más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en conjuntos múltiples. Esto normalmente se lleva a cabo utilizando uno de varios algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariable y la clasificación jerárquica ascendente, o la agrupación de k- medias .
A menudo se utilizan conjuntos de datos de decenas de miles de imágenes de partículas, y para llegar a una solución óptima se utiliza un procedimiento iterativo de alineación y clasificación, mediante el cual se utilizan promedios de imágenes fuertes producidos por clasificación como imágenes de referencia para una alineación posterior de todo el conjunto de datos. .
Filtrado de imágenes
El filtrado de imágenes (filtrado de paso de banda ) se utiliza a menudo para reducir la influencia de la información de frecuencia espacial alta y / o baja en las imágenes, lo que puede afectar los resultados de los procedimientos de alineación y clasificación. Esto es particularmente útil en imágenes de tinciones negativas . Los algoritmos hacen uso de transformadas rápidas de Fourier ( FFT ), a menudo empleando máscaras de bordes suaves con forma gaussiana en el espacio recíproco para suprimir ciertos rangos de frecuencia. Los filtros de paso alto eliminan las frecuencias espaciales bajas (como los efectos de rampa o gradiente), dejando intactas las frecuencias más altas. Los filtros de paso bajo eliminan las características de alta frecuencia espacial y tienen un efecto de desenfoque en los detalles finos.
Función de transferencia de contraste
Debido a la naturaleza de la formación de imágenes en el microscopio electrónico, las imágenes TEM de campo brillante se obtienen utilizando un enfoque bajo significativo . Esto, junto con las características inherentes al sistema de lentes del microscopio, crea imágenes borrosas visibles como una función de dispersión puntual . Los efectos combinados de las condiciones de obtención de imágenes se conocen como función de transferencia de contraste (CTF) y pueden aproximarse matemáticamente como una función en el espacio recíproco. Las técnicas de procesamiento de imágenes especializadas, como el cambio de fase y la corrección de amplitud / filtrado de wiener, pueden corregir (al menos parcialmente) el CTF y permitir reconstrucciones de alta resolución.
Reconstrucción tridimensional
Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión son proyecciones del objeto que muestran la distribución de densidad a través del objeto, similar a los rayos X médicos. Haciendo uso del teorema del corte de proyección, se puede generar una reconstrucción tridimensional del objeto combinando muchas imágenes (proyecciones 2D) del objeto tomadas desde una variedad de ángulos de visión. Las proteínas en el hielo vítreo adoptan idealmente una distribución aleatoria de orientaciones (o ángulos de visión), lo que permite una reconstrucción bastante isotrópica si se utiliza una gran cantidad de imágenes de partículas. Esto contrasta con la tomografía electrónica , donde los ángulos de visión son limitados debido a la geometría de la muestra / configuración de imagen, dando una reconstrucción anisotrópica . La retroproyección filtrada es un método comúnmente utilizado para generar reconstrucciones 3D en análisis de partículas individuales, aunque existen muchos algoritmos alternativos.
Antes de poder realizar una reconstrucción, es necesario estimar la orientación del objeto en cada imagen. Se han desarrollado varios métodos para calcular los ángulos de Euler relativos de cada imagen. Algunos se basan en líneas comunes ( sinogramas y proyecciones 1D comunes ), otros utilizan algoritmos de coincidencia de proyección iterativa. Este último funciona comenzando con un modelo inicial 3D simple y de baja resolución y compara las imágenes experimentales con las proyecciones del modelo y crea un nuevo 3D para iniciar una solución.
También hay métodos disponibles para realizar reconstrucciones en 3D de muestras helicoidales (como el virus del mosaico del tabaco ), aprovechando la simetría helicoidal inherente . Para estas muestras se pueden utilizar tanto métodos espaciales reales (que tratan secciones de la hélice como partículas individuales) como métodos espaciales recíprocos (que utilizan patrones de difracción).
Métodos de inclinación
La platina de la muestra del microscopio se puede inclinar (normalmente a lo largo de un solo eje), lo que permite la técnica de una sola partícula conocida como inclinación cónica aleatoria. Se obtiene una imagen de un área de la muestra con inclinaciones cero y de ángulo alto (~ 60-70 grados), o en el caso del método relacionado de reconstrucción de inclinación ortogonal , +45 y -45 grados. Se seleccionan pares de partículas correspondientes al mismo objeto en dos inclinaciones diferentes (pares de inclinación), y siguiendo los parámetros utilizados en las etapas posteriores de alineación y clasificación, se puede generar una reconstrucción tridimensional con relativa facilidad. Esto se debe a que el ángulo de visión (definido como tres ángulos de Euler ) de cada partícula se conoce a partir de la geometría de inclinación.
Las reconstrucciones 3D a partir de una inclinación cónica aleatoria adolecen de información faltante como resultado de un rango restringido de orientaciones. Conocido como el cono faltante (debido a la forma en el espacio recíproco), esto causa distorsiones en los mapas 3D. Sin embargo, el problema del cono faltante a menudo se puede superar combinando varias reconstrucciones de inclinación. Los métodos de inclinación son los más adecuados para muestras teñidas negativamente y se pueden usar para partículas que se adsorben a la película de soporte de carbono en orientaciones preferidas. El fenómeno conocido como movimiento de carga o inducido por haz hace que la recolección de imágenes de alta inclinación de muestras en hielo vítreo sea un desafío.
Visualización y ajuste de mapas
Hay varios programas de software disponibles que permiten visualizar los mapas en 3D. Estos a menudo permiten al usuario acoplar manualmente coordenadas de proteínas (estructuras de cristalografía de rayos X o RMN) de subunidades en la densidad de electrones. Varios programas también pueden ajustar subunidades computacionalmente.
ICP-MS de una sola partícula
La SP-ICP-MS (Espectroscopía de masas de plasma acoplada inducida por una sola partícula) se utiliza en varias áreas donde existe la posibilidad de detectar y cuantificar partículas en suspensión en muestras de fluidos ambientales, evaluando su migración, evaluando el tamaño de las partículas y su distribución. , y también determinando su estabilidad en un ambiente dado. La espectroscopia de masas de plasma de acoplamiento inductivo de una sola partícula (SP ICP-MS) fue diseñada para suspensiones de partículas en 2000 por Claude Degueldre. Primero probó esta nueva metodología en el Instituto Forel de la Universidad de Ginebra y presentó este nuevo enfoque analítico en el simposio 'Coloide 2oo2' durante la reunión de primavera de 2002 del EMRS, y en las actas de 2003 []. Este estudio presenta la teoría de SP ICP-MS y los resultados de ensayos realizados sobre partículas de arcilla (montmorillonita) así como otras suspensiones de coloides. Este método fue luego probado en nanopartículas de dióxido de torio por Degueldre y Favarger (2004), [] dióxido de circonio por Degueldre et al (2004) [] y nanopartículas de oro, que se utilizan como sustrato en nanofarmacia, y publicado por Degueldre et al ( 2006). [] Posteriormente, el estudio de las nano y micropartículas de dióxido de uranio dio lugar a una publicación detallada, Ref. Degueldre et al (2006). [] Desde 2010, el interés por SP ICP-MS se ha disparado.
Ejemplos de
- Puede obtenerse información importante sobre la síntesis de proteínas, la unión de ligandos y la interacción del ARN utilizando esta nueva técnica a resoluciones medias de 7,5 a 25 Å.
- Chaperonina de Methanococcus maripaludis , reconstruida a una resolución de 0,43 nanómetros. Este complejo de proteínas bacterianas es una máquina para doblar otras proteínas, que quedan atrapadas dentro de la cáscara.
- Ácido graso sintasa de levadura a una resolución de 0,59 nanómetros. Este enorme complejo de enzimas es responsable de construir los ácidos grasos de cadena larga esenciales para la vida celular.
- Una reconstrucción de 0,33 nanómetros de Aquareovirus . Estos virus infectan a los peces y otros animales acuáticos. La reconstrucción tiene una resolución suficientemente alta para que las densidades de las cadenas laterales de aminoácidos sean fácilmente visibles.
Base de datos primaria
Referencias
enlaces externos
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Recursos de la biblioteca sobre análisis de partículas individuales |