Microscopía de bomba-sonda - Pump-probe microscopy

La microscopía de bomba-sonda es una modalidad de imagen óptica no lineal utilizada en femtoquímica para estudiar reacciones químicas . Genera imágenes de alto contraste a partir de objetivos endógenos no fluorescentes. Tiene numerosas aplicaciones, incluida la ciencia de los materiales , la medicina y la restauración de arte .

Ventajas

El método clásico de absorción no lineal utilizado por los microscopistas es la fluorescencia de dos fotones convencional , en la que dos fotones de una sola fuente interactúan para excitar un fotoelectrón. Luego, el electrón emite un fotón cuando regresa a su estado fundamental. Este método de microscopía ha sido revolucionario en las ciencias biológicas debido a sus capacidades inherentes de corte óptico tridimensional.

La absorción de dos fotones es inherentemente un proceso no lineal : la intensidad de salida fluorescente es proporcional al cuadrado de la intensidad de la luz de excitación. Esto asegura que la fluorescencia solo se genere dentro del foco de un rayo láser, ya que la intensidad fuera de este plano es insuficiente para excitar un fotoelectrón.

Sin embargo, esta modalidad de microscopio está inherentemente limitada por el número de moléculas biológicas que sufrirán tanto la excitación de dos fotones como la fluorescencia .

La microscopía de bomba-sonda evita esta limitación midiendo directamente la luz de excitación. Esto expande el número de objetivos potenciales a cualquier molécula capaz de absorber dos fotones, incluso si no emite fluorescencia al relajarse. El método modula la amplitud de un rayo láser pulsado , denominado bomba, para llevar la molécula objetivo a un estado excitado . Esto afectará a las propiedades de un segundo haz coherente, denominado sonda, en función de la interacción de los dos haces con la molécula. Luego, un detector mide estas propiedades para formar una imagen.

Física de la microscopía de bomba-sonda

Debido a que la microscopía de sonda de bomba no se basa en objetivos fluorescentes, la modalidad aprovecha múltiples tipos diferentes de absorción multifotónica.

Absorción de dos fotones

La absorción de dos fotones (TPA) es un proceso de tercer orden en el que dos fotones son absorbidos casi simultáneamente por la misma molécula. Si un segundo fotón es absorbido por el mismo electrón dentro del mismo evento cuántico, el electrón entra en un estado excitado .

Este es el mismo fenómeno que se utiliza en la microscopía de dos fotones (TPM), pero hay dos características clave que distinguen la microscopía de bomba-sonda de la TPM. Primero, dado que la molécula no es necesariamente fluorescente, un fotodetector mide la intensidad de la sonda. Por lo tanto, la señal disminuye a medida que se produce la absorción de dos fotones, lo contrario de TPM.

En segundo lugar, la microscopía de bomba-sonda usa fuentes separadas espectralmente para cada fotón, mientras que la TPM convencional usa una fuente de una sola longitud de onda. Esto se conoce como excitación degenerada de dos fotones.

Absorción de estado excitado

La absorción en estado excitado (ESA) ocurre cuando el rayo de la bomba envía un electrón a un estado excitado, luego el rayo sonda envía el electrón a un estado excitado más alto. Esto difiere del TPA principalmente en la escala de tiempo en la que ocurre. Dado que un electrón puede permanecer en un estado excitado durante un período de nanosegundos , requiere duraciones de pulso más largas que el TPA.

Emision estimulada

La microscopía de sonda de bomba también puede medir la emisión estimulada . En este caso, el rayo de la bomba impulsa el electrón a un estado excitado. Entonces, el electrón emite un fotón cuando se expone al haz de la sonda. Esta interacción aumentará la señal de la sonda en el sitio del detector.

Agotamiento del estado fundamental

El agotamiento del estado fundamental ocurre cuando el rayo de la bomba envía el electrón a un estado excitado. Sin embargo, a diferencia de la ESA, el haz de sonda no puede enviar un electrón a un estado excitado secundario. En cambio, envía los electrones restantes del estado fundamental al primer estado excitado. Sin embargo, dado que el rayo de la bomba ha disminuido el número de electrones en el estado fundamental, se absorben menos fotones de la sonda y la señal de la sonda aumenta en el sitio del detector.

Modulación de fase cruzada

La modulación de fase cruzada es causada por el efecto Kerr : en el que el índice de refracción de la muestra cambia en presencia de un gran campo eléctrico. En este caso, el haz de la bomba modula la fase de la sonda, que luego puede medirse mediante técnicas interferométricas . En ciertos casos, denominados desplazamiento espectral de modulación de fase cruzada , este cambio de fase induce un cambio en el espectro de la bomba que puede detectarse con un filtro espectral.

Diseño óptico

Excitación

La medición de interacciones ópticas no lineales requiere un alto nivel de potencia instantánea y una sincronización muy precisa. Con el fin de lograr la gran cantidad de fotones necesarios para generar estas interacciones y evitar el daño de las muestras delicadas, estos microscopios requieren un modelo láser . Estos láseres pueden lograr recuentos de fotones muy altos en la escala de tiempo de femtosegundos y mantener una potencia media baja. La mayoría de los sistemas utilizan un medio de ganancia Ti: Sapph debido a la amplia gama de longitudes de onda a las que puede acceder.

Normalmente, se utilizará la misma fuente para generar la bomba y la sonda. Se utiliza un oscilador paramétrico óptico (OPO) para convertir el haz de la sonda a la longitud de onda deseada. La longitud de onda de la sonda se puede ajustar en un amplio rango para aplicaciones espectroscópicas.

Sin embargo, para ciertos tipos de interacciones de dos fotones, es posible utilizar fuentes de impulsos independientes. Esto solo es posible con interacciones como la absorción del estado excitado, en el que los electrones permanecen en el estado excitado durante varios picosegundos. Sin embargo, es más común usar una sola fuente de femtosegundos con dos trayectorias de haz separadas de diferentes longitudes para modular la sincronización entre los haces de la bomba y la sonda.

La amplitud del haz de la bomba se modula utilizando un modulador acústico-óptico o electro-óptico del orden de 10 ⁷ Hz. Los haces de la bomba y la sonda luego se recombinan usando un divisor de haz dicroico y se escanean usando espejos galvanométricos para la generación de imágenes punto por punto antes de enfocarse en la muestra.

Detección

La señal generada por la modulación de la sonda es mucho más pequeña que el haz de la bomba original, por lo que los dos se separan espectralmente dentro de la ruta de detección utilizando un espejo dicroico . La señal de la sonda se puede recopilar con muchos tipos diferentes de fotodetectores , normalmente un fotodiodo . Luego, la señal modulada se amplifica usando un amplificador de bloqueo sintonizado a la frecuencia de modulación de la bomba.

Análisis de los datos

De manera similar al análisis de datos hiperespectrales, los datos de imágenes de la sonda de bomba, conocidos como pila de retardo, deben procesarse para obtener una imagen con contraste molecular de la especie molecular subyacente. El procesamiento de datos de la sonda de la bomba es un desafío por varias razones; por ejemplo, las señales son bipolares (positivas y negativas), multiexponenciales y pueden alterarse significativamente por cambios sutiles en el entorno químico. Los métodos principales para el análisis de datos de la sonda de la bomba son el ajuste multi-exponencial, el análisis de componentes principales y el análisis fasorial .

Ajuste multi-exponencial

En el ajuste multi-exponencial, las curvas resueltas en el tiempo se ajustan con un modelo de caída exponencial para determinar las constantes de caída. Si bien este método es sencillo, tiene poca precisión.

Análisis de componentes principales

El análisis de componentes principales (PCA) fue uno de los primeros métodos utilizados para el análisis de datos de la sonda de la bomba, ya que se utiliza comúnmente para el análisis de datos hiperespectrales. PCA descompone los datos en componentes ortogonales. En los estudios de melanoma , los componentes principales han mostrado una buena concordancia con las señales obtenidas de las diferentes formas de melanina . Una ventaja de PCA es que el ruido se puede reducir manteniendo solo los componentes principales que representan la mayoría de la varianza en los datos. Sin embargo, los componentes principales no reflejan necesariamente las propiedades reales de las especies químicas subyacentes, que normalmente no son ortogonales. Por lo tanto, una limitación es que el número de especies químicas únicas no se puede inferir usando PCA.

Análisis fasorial

El análisis fasorial se usa comúnmente para el análisis de datos de microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM). y se ha adaptado para el análisis de datos de imágenes de bomba-sonda. Las señales se descomponen en sus partes reales e imaginarias de la transformada de Fourier a una frecuencia determinada. Al trazar las partes real e imaginaria una contra la otra, se puede mapear la distribución de diferentes cromóforos con vidas distintas. En estudios de melanoma, este enfoque ha demostrado una vez más que es capaz de distinguir entre las diferentes formas de melanina. Una de las principales ventajas del análisis fasorial es que proporciona una vista gráfica cualitativa intuitiva del contenido. También se ha combinado con PCA para el análisis cuantitativo.

Aplicaciones

El desarrollo de técnicas de imágenes de bomba-sonda de alta velocidad y alta sensibilidad ha permitido aplicaciones en varios campos, como la ciencia de los materiales, la biología y el arte.

Ciencia de los Materiales

Las imágenes de bomba-sonda son ideales para el estudio y caracterización de nanomateriales como grafeno, nanocubos, nanocables y una variedad de semiconductores, debido a sus grandes susceptibilidades pero débil fluorescencia. En particular, los nanotubos de carbono de pared simple se han estudiado exhaustivamente y se han obtenido imágenes con una resolución submicrométrica, proporcionando detalles sobre la dinámica del portador, las propiedades fotofísicas y fotoquímicas.

Biología

La primera aplicación de la técnica de la bomba-sonda en biología fue la obtención de imágenes in vitro de la emisión estimulada de una célula marcada con colorante. Las imágenes con sonda de bomba ahora se utilizan ampliamente para imágenes de melanina para diferenciar entre las dos formas principales de melanina: eumelanina (marrón / negro) y feomelanina (rojo / amarillo). En el melanoma, la eumelanina aumenta sustancialmente. Por lo tanto, obtener imágenes de la distribución de eumelanina y feomelanina puede ayudar a distinguir las lesiones benignas y el melanoma con alta sensibilidad.

Arte

La obra de arte consta de muchos pigmentos con una amplia gama de propiedades de absorción espectral, que determinan su color. Debido a las amplias características espectrales de estos pigmentos, la identificación de un pigmento específico en una mezcla es difícil. Las imágenes de la bomba-sonda pueden proporcionar información molecular precisa y de alta resolución y distinguir entre los pigmentos que incluso pueden tener el mismo color visual.

Referencias