Actividad del promotor - Promoter activity

Actividad promotora de los promotores P-RM y PR frente a la concentración de ARN polimerasa en el enterobacteriófago lamda

La actividad promotora es un término que abarca varios significados en torno al proceso de expresión génica a partir de secuencias reguladoras: promotores y potenciadores . La expresión genética se ha caracterizado comúnmente como una medida de cuánto, qué tan rápido, cuándo y dónde ocurre este proceso. Se requieren promotores y potenciadores para controlar dónde y cuándo se transcribe un gen específico.

Tradicionalmente, la medición de productos génicos (es decir, ARNm, proteínas, etc.) ha sido el enfoque principal para medir la actividad promotora. Sin embargo, este método se enfrenta a dos cuestiones: la naturaleza estocástica de la expresión génica y la falta de interpretación mecanicista del proceso termodinámico implicado en la activación del promotor.

Los desarrollos reales en metabolómica producto de desarrollos de tecnologías de secuenciación de próxima generación y análisis estructural molecular han permitido el desarrollo de modelos más precisos del proceso de activación del promotor (por ejemplo, la estructura sigma de los dominios holoenzimáticos de la polimerasa) y una mejor comprensión de las complejidades. de los factores regulatorios involucrados.

Vinculación del promotor

Probabilidad de unión para los promotores T7 (verde) y Lac Ecoli (azul) por concentraciones de ARN polimerasa.

El proceso de unión es fundamental para determinar la "fuerza" de los promotores, es decir, la estimación relativa de qué tan "bien" un promotor realiza la expresión de un gen en circunstancias específicas. Brewster et al., Utilizando un modelo termodinámico simple basado en el postulado de que la actividad transcripcional es proporcional a la probabilidad de encontrar la ARN polimerasa unida al promotor, obtuvieron predicciones del escalamiento de la energía de unión de la ARN polimerasa. Estos modelos apoyan la relación entre la probabilidad de unión y el resultado de la expresión génica.

Representación matemática de la unión del promotor

El problema de la regulación génica podría representarse matemáticamente como la probabilidad de que n moléculas (RNAP, activadores, represores e inductores) estén unidas a regiones objetivo.

Para calcular la probabilidad de unión, es necesario sumar los pesos de Boltzmann sobre todos los estados posibles de las moléculas de polimerasa. ${\ Displaystyle P}$

en el ADN. Aquí en esta deducción está el número efectivo de moléculas de RNAP disponibles para unirse al promotor. ${\ Displaystyle P}$

Este enfoque se basa en la termodinámica estadística de dos posibles resultados microscópicos:

1. un estado en el que todas las moléculas de P polimerasas se distribuyen entre todos los sitios no específicos (sitios que no participan en la expresión génica)
2. un promotor ocupado y las polimerasas P-1 restantes distribuidas entre los sitios no específicos.

El peso estadístico del promotor desocupado Z (P) se define:

${\ Displaystyle Z (P) = ~ {\ frac {N_ {NS}!} {P! * (N_ {NS} -P)!}} * {e} ^ {- ~ {\ frac {E_ {NS} } {KbT}}}}$

Donde el primer término es el resultado combinatorio de la polimerasa tomada de sitios no específicos disponibles, y el segundo término son los pesos de Boltzmann , donde es la energía que representa la energía de unión promedio de la ARN polimerasa al fondo genómico (sitios no específicos) . ${\ Displaystyle P}$${\ Displaystyle N_ {NS}}$${\ Displaystyle E_ {NS}}$

Luego, el peso estadístico total se puede escribir como la suma del estado y la ARN polimerasa en el estado del promotor: ${\ Displaystyle Z (Ptotal)}$${\ Displaystyle Z (P)}$

${\ Displaystyle Z (Ptotal) = Z (P) + Z (P-1) * {e} ^ {- ~ {\ frac {E_ {S}} {KbT}}}}$

Dónde en el estado está la energía de unión para la ARN polimerasa en el promotor (donde la s significa sitio específico). ${\ Displaystyle E_ {S}}$${\ Displaystyle Z (P-1)}$

Finalmente, para encontrar la probabilidad de que una ARN polimerasa se una ( ) a un promotor específico, dividimos por cuál produce: ${\ Displaystyle Prob_ {límite}}$${\ Displaystyle Z (P)}$${\ Displaystyle Z (Ptotal)}$

${\ Displaystyle Prob_ {límite} = {\ frac {1} {1 + {\ frac {N_ {N} S} {P}} * {e} ^ {- {\ frac {\ Delta E} {KbT}} }}}}$

Dónde, ${\ Displaystyle \ Delta E = E_ {S} -E_ {NS}}$

Un resultado importante de este modelo es que cualquier factor de transcripción, regulador o perturbación podría introducirse como un término que se multiplica en la ecuación de probabilidad de unión. Este término para cualquier factor de transcripción (aquí llamado reguladores de factor) modifica la probabilidad de unirse a: ${\ Displaystyle P}$

${\ Displaystyle Prob_ {límite} = {\ frac {1} {1 + {\ frac {N_ {N} S} {P * F_ {R}}} * {e} ^ {- {\ frac {\ Delta E } {KbT}}}}}}$

Donde es el término para factores de transcripción, y tiene el valor de para aumentar o para disminuir el número de ARN polimerasa disponible para unirse. ${\ Displaystyle F_ {R}}$${\ Displaystyle F_ {R}> 1}$${\ Displaystyle F_ {R} <1}$

Este resultado tiene un significado importante para representar matemáticamente todas las configuraciones posibles de factor de transcripción derivando diferentes modelos para estimar (para más desarrollos, ver también). ${\ Displaystyle F_ {R}}$

Estructura promotora de eucariotas

Elementos principales del promotor.

El proceso de activación y unión en eucariotas es diferente al de las bacterias en la forma en que los elementos específicos del ADN se unen a los factores para un complejo de preiniciación funcional. En las bacterias hay una sola polimerasa, que contiene subunidades catalíticas y una sola subunidad reguladora conocida como sigma , que se transcribe para diferentes tipos de genes.

En eucariotas, la transcripción se realiza mediante tres ARN polimerasa diferentes, ARN pol I para ARN ribosomales (ARNr), ARN polimerasa II para ARN mensajeros (ARNm) y algunos ARN reguladores pequeños, y la ARN polimerasa III para ARN pequeños como ARN de transferencia (ARNt). El proceso de posicionamiento de la ARN polimerasa II y la maquinaria transcripcional requieren el reconocimiento de una región conocida como "promotor central". Los elementos que podrían encontrarse en el promotor central incluyen el elemento TATA, el elemento de reconocimiento TFIIB (BRE), el iniciador (Inr) y el elemento promotor central aguas abajo (DPE). Los promotores en eucariotas contienen uno o más de estos elementos promotores centrales (pero cualquiera de ellos es absolutamente esencial para la función del promotor), estos elementos son sitios de unión para subunidades de la maquinaria transcripcional y están involucrados en el inicio de la transcripción, pero también tienen algunas funciones potenciadoras específicas. Además, la actividad promotora en eucariotas incluye algunas complejidades en la forma en que integran señales de factores distales con el promotor central.

Procesos evolutivos

A diferencia de las regiones codificantes de proteínas, donde se ha demostrado con frecuencia la suposición de la conservación de la secuencia de genes funcionalmente homólogos, no existe una relación clara de conservación entre las secuencias y sus funciones para las regiones reguladoras. Las regiones promotoras de la transcripción están sometidas a una selección menos rigurosa, luego tienen tasas de sustitución más altas, lo que permite que los sitios de unión a los factores de transcripción se reemplacen fácilmente por otros nuevos que surgen de mutaciones aleatorias. A pesar de los cambios de secuencia, se conservan principalmente las funciones de las secuencias reguladoras.

En los últimos años con el aumento de la disponibilidad de secuencias del genoma, la huella filogenética abre la posibilidad de identificar elementos cis y luego estudiar sus procesos de evolución. En este sentido, Raijman et al., Dermitzakis et al. han desarrollado técnicas para analizar procesos evolutivos en regiones de factores de transcripción en promotores de especies de Saccharomyces y redes reguladoras de mamíferos, respectivamente.

La base de muchos de estos cambios evolutivos en la naturaleza probablemente esté relacionada con eventos dentro de las regiones reguladoras cis involucradas en la expresión génica. El impacto de la variación en las regiones reguladoras es importante para el riesgo de enfermedad debido a su impacto en el nivel de expresión génica. Además, las perturbaciones en las propiedades de unión de las proteínas codificadas por genes reguladores se han relacionado con efectos de fenotipos tales como estructuras duplicadas, transformaciones homeóticas y morfologías novedosas.

Medida de la actividad promotora

La medida de la actividad promotora tiene un significado amplio. La actividad promotora podría medirse para diferentes situaciones o preguntas de investigación, tales como:

• estimación del nivel de expresión en comparación (relativa) con algún valor conocido
• qué tan rápido se expresa un gen después de la inducción
• el momento de la expresión en relación con otros genes
• la ubicación espacial específica de expresión

Los métodos para estudiar la actividad promotora se basan comúnmente en la expresión de un gen indicador del promotor del gen de interés. Las mutaciones y deleciones se realizan en una región promotora y se miden sus cambios en la expresión de pareja del gen informador.

Los genes informadores más importantes son las proteínas de fluorescencia como GFP . Estos indicadores permiten medir la activación del promotor aumentando las señales fluorescentes y la desactivación mediante la disminución de la tasa de fluorescencia.

Ver también

Referencias