pUC19 - pUC19
pUC19 es uno de una serie de vectores de clonación de plásmidos creados por Joachim Messing y colaboradores. La designación "pUC" se deriva del prefijo "p" clásico (que denota " plásmido ") y la abreviatura de la Universidad de California , donde se habían realizado los primeros trabajos sobre la serie de plásmidos. Es un ADN circular de doble hebra y tiene 2686 pares de bases. pUC19 es una de las moléculas de vector más ampliamente utilizadas, ya que los recombinantes , o las células en las que se ha introducido ADN extraño, pueden distinguirse fácilmente de los no recombinantes basándose en las diferencias de color de las colonias en los medios de crecimiento. pUC18 es similar a pUC19, pero la región MCS está invertida.
Componentes
En particular, tiene un fragmento N-terminal del gen de la β-galactosidasa ( lacZ ) de E. coli . La región del sitio de clonación múltiple (MCS) se divide en los codones 6-7 del gen lacZ, lo que proporciona muchos sitios de restricción de endonucleasas de restricción . Además de la β-galactosidasa, pUC19 también codifica un gen de resistencia a la ampicilina (amp R ), a través de una enzima β-lactamasa que funciona degradando la ampicilina y reduciendo su toxicidad para el huésped.
El sitio ori , o el origen de la replicación , se deriva del plásmido pMB1. pUC19 es pequeño pero tiene un alto número de copias. El alto número de copias es el resultado de la falta del gen rop y una mutación puntual única en el ori de pMB1. El gen lacZ codifica la β-galactosidasa . Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción HindIII , SphI , PstI , SalI , XbaI , BamHI , SmaI , KpnI , SacI y EcoRI se han derivado del vector M13mp19.
Función
Este plásmido se introduce en una célula bacteriana mediante un proceso llamado " transformación ", donde puede multiplicarse y expresarse. Sin embargo, debido a la presencia de MCS y varios sitios de restricción, se puede introducir un fragmento extraño de ADN de elección insertándolo en su lugar en la región MCS. Las células que han absorbido el plásmido pueden diferenciarse de las células que no han absorbido el plásmido haciéndolo crecer en un medio con ampicilina. Solo sobrevivirán las células con el plásmido que contiene el gen de resistencia a ampicilina ( amp R ). Además, las células transformadas que contienen el plásmido con el gen de interés se pueden distinguir de las células con el plásmido pero sin el gen de interés, simplemente mirando el color de la colonia que producen en medio de agar suplementado con IPTG y X-gal . Los recombinantes son blancos, mientras que los no recombinantes son azules.
Mecanismo
El fragmento lac Z , cuya síntesis puede ser inducida por IPTG, es capaz de complementación intraalélica con una forma defectuosa de la enzima β-galactosidasa codificada por el cromosoma del huésped (mutación lacZDM15 en las cepas de E. coli JM109, DH5α y XL1-Blue). En presencia de IPTG en el medio de crecimiento, las bacterias sintetizan ambos fragmentos de la enzima. Ambos fragmentos pueden hidrolizar juntos X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido) y formar colonias azules cuando se cultivan en medios donde se complementa.
La inserción de ADN extraño en el MCS ubicado dentro del gen lac Z provoca la inactivación por inserción de este gen en el fragmento N-terminal de la beta-galactosidasa y anula la complementación intraalélica. Por tanto, las bacterias que llevan plásmidos recombinantes en el MCS no pueden hidrolizar X-gal, dando lugar a colonias blancas, que pueden distinguirse en los medios de cultivo de las células no recombinantes, que son azules.
Por lo tanto, los medios utilizados deben contener ampicilina , IPTG y X-gal .
Uso en investigación
Debido a su amplio uso como vector de clonación en la investigación y la industria, pUC19 se usa con frecuencia en la investigación como plásmido modelo. Por ejemplo, los estudios biofísicos sobre su estado superenrollado natural han determinado que su radio de giro es de 65,6 nm y su radio de Stokes es de 43,6 nm.