Biblioteca (biología) - Library (biology)

La mutagénesis por saturación del sitio es un tipo de mutagénesis dirigida al sitio . Esta imagen muestra la mutagénesis de saturación de una sola posición en una proteína teórica de 10 residuos. La versión de tipo salvaje de la proteína se muestra en la parte superior, donde M representa el primer aminoácido metionina y * representa la terminación de la traducción. Los 19 mutantes de la isoleucina en la posición 5 se muestran a continuación.

Cómo se generan las bibliotecas de ADN por mutagénesis aleatoria en el espacio de la secuencia de la muestra. Se muestra el aminoácido sustituido en una posición dada. Cada punto o conjunto de puntos conectados es un miembro de la biblioteca. La PCR propensa a errores muta aleatoriamente algunos residuos en otros aminoácidos. El escaneo de alanina reemplaza cada residuo de la proteína con alanina, uno por uno. La saturación del sitio sustituye a cada uno de los 20 aminoácidos posibles (o algún subconjunto de ellos) en una sola posición, uno por uno.

En biología molecular , una biblioteca es una colección de fragmentos de ADN que se almacena y se propaga en una población de microorganismos mediante el proceso de clonación molecular . Existen diferentes tipos de bibliotecas de ADN, incluidas las bibliotecas de ADNc (formadas a partir de ARN transcrito de forma inversa ), las bibliotecas genómicas (formadas a partir de ADN genómico) y las bibliotecas mutantes aleatorias (formadas por síntesis de genes de novo donde se incorporan nucleótidos o codones alternativos). La tecnología de las bibliotecas de ADN es un pilar de la biología molecular , la ingeniería genética y la ingeniería de proteínas actuales , y las aplicaciones de estas bibliotecas dependen de la fuente de los fragmentos de ADN originales. Existen diferencias en los vectores de clonación y las técnicas utilizadas en la preparación de bibliotecas, pero en general cada fragmento de ADN se inserta de forma única en un vector de clonación y el conjunto de moléculas de ADN recombinante se transfiere luego a una población de bacterias (un cromosoma artificial bacteriano o biblioteca BAC ) o levadura de manera que cada organismo contenga en promedio una construcción (vector + inserto). A medida que la población de organismos crece en cultivo, las moléculas de ADN contenidas en ellos se copian y propagan (por lo tanto, se "clonan").

Terminología

El término "biblioteca" puede referirse a una población de organismos, cada uno de los cuales lleva una molécula de ADN insertada en un vector de clonación, o alternativamente a la colección de todas las moléculas de vector clonadas.

bibliotecas de ADNc

Una biblioteca de ADNc representa una muestra del ARNm purificado de una fuente particular (ya sea una colección de células, un tejido particular o un organismo completo), que se ha convertido nuevamente en una plantilla de ADN mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa . Por lo tanto, representa los genes que se estaban transcribiendo activamente en esa fuente particular en las condiciones fisiológicas, de desarrollo o ambientales que existían cuando se purificó el ARNm. Se pueden generar bibliotecas de ADNc usando técnicas que promueven clones de "longitud completa" o en condiciones que generan fragmentos más cortos usados ​​para la identificación de " etiquetas de secuencia expresadas ".

Las bibliotecas de ADNc son útiles en genética inversa, pero solo representan una porción muy pequeña (menos del 1%) del genoma general en un organismo dado.

Las aplicaciones de las bibliotecas de ADNc incluyen:

• Descubrimiento de genes nuevos
• Clonación de moléculas de ADNc de longitud completa para el estudio in vitro de la función genética
• Estudio del repertorio de ARNm expresados ​​en diferentes células o tejidos
• Estudio de empalmes alternativos en diferentes células o tejidos

Bibliotecas genómicas

Una biblioteca genómica es un conjunto de clones que juntos representan el genoma completo de un organismo determinado. El número de clones que constituyen una biblioteca genómica depende de (1) el tamaño del genoma en cuestión y (2) el tamaño del inserto tolerado por el sistema de vector de clonación particular . Para la mayoría de los propósitos prácticos, la fuente de tejido del ADN genómico no es importante porque cada célula del cuerpo contiene ADN virtualmente idéntico (con algunas excepciones).

Las aplicaciones de las bibliotecas genómicas incluyen:

• Determinación de la secuencia completa del genoma de un organismo determinado (ver proyecto genoma )
• Sirviendo como fuente de secuencia genómica para la generación de animales transgénicos mediante ingeniería genética
• Estudio de la función de secuencias reguladoras in vitro
• Estudio de mutaciones genéticas en tejidos cancerosos

Bibliotecas mutantes sintéticas

Representación de una forma común de clonar una biblioteca de mutagénesis dirigida al sitio (es decir, usando oligos degenerados). El gen de interés se somete a PCR con oligos que contienen una región que es perfectamente complementaria a la plantilla (azul) y una que se diferencia de la plantilla por uno o más nucleótidos (rojo). Muchos de estos cebadores que contienen degeneración en la región no complementaria se combinan en la misma PCR, lo que da como resultado muchos productos de PCR diferentes con diferentes mutaciones en esa región (mutantes individuales que se muestran con diferentes colores a continuación).

En contraste con los tipos de bibliotecas descritos anteriormente, existe una variedad de métodos artificiales para hacer bibliotecas de genes variantes. La variación en todo el gen se puede introducir aleatoriamente mediante PCR propensa a errores , mezcla de ADN para recombinar partes de genes similares o métodos basados ​​en transposones para introducir indeles . Alternativamente, las mutaciones pueden ser dirigidos a los codones específicos en la de novo síntesis o mutagénesis de saturación para la construcción de uno o más mutantes puntuales de un gen en una forma controlada. Esto da como resultado una mezcla de moléculas de ADN de doble hebra que representan variantes del gen original.

Las proteínas expresadas a partir de estas bibliotecas se pueden cribar en busca de variantes que presenten propiedades favorables (por ejemplo, estabilidad, afinidad de unión o actividad enzimática). Esto se puede repetir en ciclos de creación de variantes genéticas y selección de productos de expresión en un proceso de evolución dirigida .

Descripción general de las técnicas de preparación de bibliotecas de ADNc

Extracción de ADN

Si se crea una biblioteca de ARNm (es decir, con clones de ADNc), existen varios protocolos posibles para aislar ARNm de longitud completa. Para extraer ADN para bibliotecas de ADN genómico (también conocido como ADNg), puede ser útil una minipreparación de ADN.

Preparar insertos

Las bibliotecas de ADNc requieren cuidado para asegurar que los clones de ARNm de longitud completa se capturen como ADNc (que luego se insertará en los vectores). Se han diseñado varios protocolos para optimizar la síntesis de la 1ª hebra de cDNA y la 2ª hebra de cDNA por esta razón, y también para hacer más probable la clonación direccional en el vector.

Los fragmentos de ADNg se generan a partir del ADNg extraído mediante el uso de enzimas de restricción de corte frecuentes no específicas.

Vectores

Las secuencias de nucleótidos de interés se conservan como inserciones en un plásmido o en el genoma de un bacteriófago que se ha utilizado para infectar células bacterianas.

Los vectores se propagan más comúnmente en células bacterianas, pero si se usa un YAC (cromosoma artificial de levadura), se pueden usar células de levadura. Los vectores también se pueden propagar en virus, pero esto puede llevar mucho tiempo y ser tedioso. Sin embargo, la alta eficacia de transfección lograda mediante el uso de virus (a menudo fagos) los hace útiles para empaquetar el vector (con el inserto ligado) y luego introducirlos en la célula bacteriana (o de levadura).

Además, para las bibliotecas de ADNc, se ha desarrollado un sistema que utiliza el fago Lambda Zap II, ExAssist y 2 especies de E. coli. En su lugar, también se puede usar un sistema Cre-Lox que usa sitios loxP y la expresión in vivo de la enzima recombinasa. Estos son ejemplos de sistemas de escisión in vivo. La escisión in vitro implica subclonación a menudo utilizando enzimas de restricción tradicionales y estrategias de clonación. La escisión in vitro puede llevar más tiempo y puede requerir más trabajo "práctico" que los sistemas de escisión in vivo. En cualquier caso, los sistemas permiten el movimiento del vector desde el fago a una célula viva, donde el vector puede replicarse y propagarse hasta que se vaya a utilizar la biblioteca.

Usar bibliotecas

Flujo de trabajo para el cribado de una biblioteca sintética para identificar células que producen una sustancia química de interés.

Esto implica "cribado" de las secuencias de interés. Hay varios métodos posibles para lograrlo.

Referencias

enlaces externos