Electroforesis en gel de ácidos nucleicos - Gel electrophoresis of nucleic acids
La electroforesis de ácidos nucleicos es una técnica analítica que se utiliza para separar fragmentos de ADN o ARN por tamaño y reactividad. Las moléculas de ácido nucleico que se van a analizar se colocan en un medio viscoso, el gel , donde un campo eléctrico induce a los ácidos nucleicos (que están cargados negativamente debido a su estructura de azúcar- fosfato ) a migrar hacia el ánodo (que está cargado positivamente porque esta es una celda electrolítica en lugar de galvánica ). La separación de estos fragmentos se logra aprovechando las movilidades con las que moléculas de diferentes tamaños pueden atravesar el gel. Las moléculas más largas migran más lentamente porque experimentan más resistencia dentro del gel. Debido a que el tamaño de la molécula afecta su movilidad, los fragmentos más pequeños terminan más cerca del ánodo que los más largos en un período determinado. Después de algún tiempo, se elimina el voltaje y se analiza el gradiente de fragmentación. Para separaciones más grandes entre fragmentos de tamaño similar, se puede aumentar el voltaje o el tiempo de ejecución. Los recorridos prolongados a través de un gel de bajo voltaje producen la resolución más precisa. Sin embargo, el voltaje no es el único factor que determina la electroforesis de ácidos nucleicos.
El ácido nucleico a separar se puede preparar de varias formas antes de la separación por electroforesis. En el caso de moléculas de ADN grandes, el ADN se corta con frecuencia en fragmentos más pequeños utilizando una endonucleasa de restricción de ADN (o enzima de restricción). En otros casos, como las muestras amplificadas por PCR , las enzimas presentes en la muestra que podrían afectar la separación de las moléculas se eliminan por diversos medios antes del análisis. Una vez que el ácido nucleico está preparado adecuadamente, las muestras de la solución de ácido nucleico se colocan en los pocillos del gel y se aplica un voltaje a través del gel durante un período de tiempo específico.
Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se visualizan utilizando un colorante fluorescente específico para el ADN, como el bromuro de etidio . El gel muestra bandas correspondientes a diferentes poblaciones de moléculas de ácido nucleico con diferente peso molecular. El tamaño de los fragmentos se informa habitualmente en "nucleótidos", "pares de bases" o "kb" (para miles de pares de bases) dependiendo de si se ha separado el ácido nucleico monocatenario o bicatenario. La determinación del tamaño de los fragmentos se realiza normalmente por comparación con marcadores de ADN disponibles comercialmente que contienen fragmentos de ADN lineales de longitud conocida.
Los tipos de gel más comúnmente utilizados para la electroforesis de ácidos nucleicos son agarosa (para moléculas de ADN relativamente largas) y poliacrilamida (para alta resolución de moléculas de ADN cortas, por ejemplo, en secuenciación de ADN ). Los geles se han procesado convencionalmente en un formato de "placa" como el que se muestra en la figura, pero la electroforesis capilar se ha vuelto importante para aplicaciones como la secuenciación de ADN de alto rendimiento. Las técnicas de electroforesis utilizadas en la evaluación del daño del ADN incluyen la electroforesis en gel alcalino y la electroforesis en gel de campo pulsado .
Para segmentos de ADN cortos, como ADN de doble hebra de 20 a 60 pb, ejecutarlos en gel de poliacrilamida (PAGE) dará una mejor resolución (condición nativa). De manera similar, el ARN y el ADN monocatenario pueden analizarse y visualizarse mediante geles PAGE que contienen agentes desnaturalizantes como la urea. Los geles PAGE se utilizan ampliamente en técnicas como la impresión de pie de ADN, EMSA y otras técnicas de interacción ADN-proteína.
La medición y el análisis se realizan principalmente con un software de análisis de gel especializado. Los resultados de la electroforesis capilar normalmente se muestran en una vista de trazas llamada electroferograma .
Factores que afectan la migración de ácidos nucleicos.
Varios factores pueden afectar la migración de los ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración de colorante intercalante , como el bromuro de etidio, si se utiliza durante la electroforesis.
Tamaño del ADN
El gel tamiza el ADN según el tamaño de la molécula de ADN, por lo que las moléculas más pequeñas viajan más rápido. El ADN de doble hebra se mueve a una velocidad que es aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes y no es posible separarlos usando electroforesis en gel de agarosa estándar . El límite de resolución depende de la composición del gel y la intensidad del campo. y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que el ADN lineal por el tamaño de los poros del gel. La separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere electroforesis en gel de campo de pulsos (PFGE). En la electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE, una especie de PFGE), es posible tener una "inversión de banda", donde las moléculas grandes pueden moverse más rápido que las moléculas pequeñas.
Conformación del ADN
La conformación de la molécula de ADN puede afectar significativamente el movimiento del ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado generalmente se mueve más rápido que el ADN relajado porque está estrechamente enrollado y, por lo tanto, más compacto. En una preparación normal de ADN plasmídico, pueden estar presentes múltiples formas de ADN, y el gel de la electroforesis de los plásmidos normalmente mostraría una banda principal que sería la forma superenrollada negativamente, mientras que otras formas de ADN pueden aparecer como bandas menores más débiles. Estas bandas menores pueden ser ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada que normalmente se ejecuta más lentamente que el ADN superenrollado , y la forma monocatenaria (que a veces puede aparecer dependiendo de los métodos de preparación) puede avanzar por delante del ADN superenrollado. . Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las diversas formas puede cambiar usando diferentes condiciones de electroforesis, por ejemplo, el ADN lineal puede correr más rápido o más lento que el ADN superenrollado dependiendo de las condiciones, y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que el ADN lineal por el poro. tamaño del gel. A menos que se utilicen marcadores de ADN superenrollado , el tamaño de un plásmido similar al ADN circular se puede medir con mayor precisión después de que se haya linealizado mediante digestión por restricción .
El daño del ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración del ADN electroforético de una manera dependiente de la dosis.
Concentración de bromuro de etidio
El ADN circular se ve más afectado por la concentración de bromuro de etidio que el ADN lineal si hay bromuro de etidio en el gel durante la electroforesis. Todos los círculos de ADN de origen natural están subenrollados, pero el bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia durante la electroforesis puede afectar su movimiento en gel. El aumento de bromuro de etidio intercalado en el ADN puede cambiarlo de una molécula superenrollada negativamente a una forma completamente relajada, y luego a una superhélice enrollada positivamente en la intercalación máxima. La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver ADN circular con diferentes topologías de superenrollamiento.
Concentración de gel
La concentración del gel determina el tamaño de los poros del gel que afecta la migración del ADN. La resolución del ADN cambia con la concentración porcentual del gel. El aumento de la concentración de agarosa de un gel reduce la velocidad de migración y mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que la reducción de la concentración de gel permite que se separen moléculas de ADN grandes. Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, un 0,7% proporciona una buena separación o resolución de fragmentos de ADN grandes de 5 a 10 kb, mientras que un gel al 2% proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb. Se puede usar hasta un 3% para separar fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical sería más apropiado para resolver fragmentos pequeños. Sin embargo, el gel de altas concentraciones requiere tiempos de ejecución más largos (a veces días) y los geles de alto porcentaje son a menudo frágiles y pueden no fraguar uniformemente. Los geles de agarosa de alto porcentaje deben procesarse con PFGE o FIGE. Los geles de bajo porcentaje (0,1-0,2%) son frágiles y pueden romperse. Los geles al 1% son comunes para muchas aplicaciones.
Campo aplicado
A bajos voltajes, la tasa de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, al aumentar la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular aumenta diferencialmente y el rango efectivo de separación disminuye y, por lo tanto, la resolución es menor a alto voltaje. Para una resolución óptima de ADN de un tamaño superior a 2 kb en electroforesis en gel estándar, se recomiendan de 5 a 8 V / cm. El voltaje también está limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se hace funcionar un gel a alto voltaje durante un período prolongado, particularmente para el gel de agarosa de bajo punto de fusión.
Sin embargo, la movilidad del ADN puede cambiar en un campo inestable. En un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclo particular. Este fenómeno puede resultar en una inversión de banda por la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños en PFGE.
Mecanismo de migración y separación
La carga negativa de su cadena principal de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis, es decir, no hay separación por tamaño sin una matriz de gel. La interacción hidrodinámica entre diferentes partes del ADN se interrumpe mediante la transmisión de contraiones que se mueven en la dirección opuesta, por lo que no existe ningún mecanismo para generar una dependencia de la velocidad de la longitud en una escala mayor que la longitud de detección de aproximadamente 10 nm. Esto lo diferencia de otros procesos como la sedimentación o la difusión donde la interacción hidrodinámica de largo alcance es importante.
Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, sin embargo, el mecanismo preciso responsable de la separación no está del todo claro. Existe una serie de modelos para el mecanismo de separación de biomoléculas en matriz de gel, uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz de polímero como un tamiz que consiste en una red distribuida aleatoriamente de poros interconectados. Una proteína globular o un ADN en espiral aleatorio se mueve a través de los poros conectados lo suficientemente grandes como para acomodar su paso, y es más probable que el movimiento de moléculas más grandes se vea obstaculizado y ralentizado por las colisiones con la matriz del gel, por lo que las moléculas de diferentes tamaños pueden separarse en este proceso de tamizado.
Sin embargo, el modelo de Ogston se descompone para moléculas grandes, por lo que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, se utiliza con mayor frecuencia un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo asume que el ADN puede arrastrarse en forma de "serpiente" (de ahí "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. A mayor intensidad de campo eléctrico, esto se convirtió en un modelo de reptación sesgado, en el que el extremo delantero de la molécula se polariza fuertemente en la dirección de avance, y este borde delantero arrastra al resto de la molécula. En el modo totalmente sesgado, la movilidad alcanzó un punto de saturación y el ADN más allá de un cierto tamaño no se puede separar. Sin embargo, en la práctica no se observa una alineación paralela perfecta de la cadena con el campo, ya que eso significaría la misma movilidad para moléculas largas y cortas. Un mayor refinamiento del modelo de reptación sesgada tiene en cuenta las fluctuaciones internas de la cadena.
El modelo de reptación sesgada también se ha utilizado para explicar la movilidad del ADN en PFGE. La orientación del ADN se construye progresivamente por reptación después del inicio de un campo, y el momento en que alcanzó la velocidad de estado estable depende del tamaño de la molécula. Cuando el campo cambia, las moléculas más grandes tardan más en reorientarse, por lo que es posible discriminar entre las cadenas largas que no pueden alcanzar su velocidad de estado estable de las cortas que viajan la mayor parte del tiempo a velocidad constante. Sin embargo, también existen otros modelos.
La microscopía de fluorescencia en tiempo real de moléculas teñidas mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, con el ADN mostrando una elasticidad considerable, ya que se estira alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego se contrae en una bola, o se engancha en forma de U cuando se pone atrapado en las fibras de polímero. Esta observación puede denominarse modelo de "oruga". Otro modelo propone que el ADN se enreda con la matriz del polímero, y cuanto más grande es la molécula, más probable es que se enrede y se impida su movimiento.
Visualización
El tinte más común utilizado para hacer visibles las bandas de ADN o ARN para la electroforesis en gel de agarosa es el bromuro de etidio , generalmente abreviado como EtBr. Emite fluorescencia bajo luz ultravioleta cuando se intercala en el surco principal del ADN (o ARN). Al pasar el ADN a través de un gel tratado con EtBr y visualizarlo con luz ultravioleta, cualquier banda que contenga más de ~ 20 ng de ADN se vuelve claramente visible. EtBr es un mutágeno conocido y existen alternativas más seguras, como GelRed , producido por Biotium , que se une al surco menor.
SYBR Green I es otra tinción de dsDNA, producida por Invitrogen . Es más caro, pero 25 veces más sensible y posiblemente más seguro que el EtBr, aunque no hay datos que aborden su mutagenicidad o toxicidad en humanos.
SYBR Safe es una variante de SYBR Green que ha demostrado tener niveles lo suficientemente bajos de mutagenicidad y toxicidad como para ser considerado un residuo no peligroso según las regulaciones federales de EE. UU. Tiene niveles de sensibilidad similares a EtBr, pero, como SYBR Green, es significativamente más caro. Sin embargo, en países donde la eliminación segura de desechos peligrosos es obligatoria, los costos de eliminación de EtBr pueden superar fácilmente la diferencia de precio inicial.
Dado que el ADN teñido con EtBr no es visible a la luz natural, los científicos mezclan el ADN con tampones de carga cargados negativamente antes de agregar la mezcla al gel. Los tampones de carga son útiles porque son visibles con luz natural (a diferencia de la luz ultravioleta para el ADN teñido con EtBr) y se sedimentan conjuntamente con el ADN (lo que significa que se mueven a la misma velocidad que el ADN de cierta longitud). El xileno cianol y el azul de bromofenol son colorantes comunes que se encuentran en los tampones de carga; corren aproximadamente a la misma velocidad que los fragmentos de ADN que tienen 5000 pb y 300 pb de longitud respectivamente, pero la posición precisa varía con el porcentaje del gel. Otros marcadores de progreso utilizados con menos frecuencia son el rojo cresol y el naranja G, que se ejecutan a aproximadamente 125 pb y 50 pb, respectivamente.
La visualización también se puede lograr transfiriendo ADN después de SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa seguido de exposición a una sonda de hibridación . Este proceso se denomina transferencia Southern .
Para los tintes fluorescentes, después de la electroforesis, el gel se ilumina con una lámpara ultravioleta (generalmente colocándolo en una caja de luz, mientras se usa equipo protector para limitar la exposición a la radiación ultravioleta). El aparato iluminador en su mayoría también contiene un aparato de formación de imágenes que toma una imagen del gel, después de la iluminación con radiación UV. El bromuro de etidio presenta una fluorescencia naranja rojiza en presencia de ADN, ya que se ha intercalado con el ADN. La banda de ADN también se puede cortar del gel y luego se puede disolver para recuperar el ADN purificado. Luego, el gel se puede fotografiar generalmente con una cámara digital o polaroid. Aunque el ácido nucleico teñido tiene una fluorescencia de color naranja rojizo, las imágenes suelen mostrarse en blanco y negro (véanse las figuras). El daño de los rayos UV a la muestra de ADN puede reducir la eficiencia de la manipulación posterior de la muestra, como la ligadura y la clonación. Las radiaciones UV de longitud de onda más corta (302 o 312 nm) causan un daño mayor; por ejemplo, una exposición de tan solo 45 segundos puede reducir significativamente la eficiencia de transformación . Por lo tanto, si el ADN se va a utilizar para procedimientos posteriores, debe limitarse la exposición a radiaciones ultravioleta de longitud de onda más corta; en su lugar, debe utilizarse radiación ultravioleta de longitud de onda más alta (365 nm) que causa menos daño. Sin embargo, las radiaciones de longitud de onda más alta producen una fluorescencia más débil, por lo tanto, si es necesario capturar la imagen del gel, se puede usar una luz UV de longitud de onda más corta durante un período breve. La adición de citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger al ADN del daño. Alternativamente, se puede usar una fuente de excitación de luz azul con un colorante azul excitable como SYBR Green o GelGreen .
La investigación de electroforesis en gel a menudo se beneficia de herramientas de análisis de imágenes basadas en software, como ImageJ .
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El gel con iluminación UV, el ADN teñido con bromuro de etidio se ilumina en naranja
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Foto digital del gel. Carril 1. Marcadores de ADN comerciales (1 kb plus), Carril 2. vacío, Carril 3. un producto de PCR de poco más de 500 bases, Carril 4. Digesto de restricción que muestra un fragmento similar cortado de un vector plasmídico de 4.5 kb
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