Diferenciación dirigida - Directed differentiation
Diferenciación dirigida es una bioingeniería metodología en la interfase de la biología de células madre , la biología del desarrollo y la ingeniería de tejidos . Básicamente, se trata de aprovechar el potencial de las células madre limitando su diferenciación in vitro hacia un tipo de célula o tejido específico de interés. Las células madre son, por definición , pluripotentes , capaces de diferenciarse en varios tipos de células como neuronas , cardiomiocitos , hepatocitos , etc. La diferenciación dirigida eficaz requiere una comprensión detallada del linaje y la decisión del destino celular , a menudo proporcionada por la biología del desarrollo.
Marco conceptual
Durante la diferenciación, las células pluripotentes toman una serie de decisiones de desarrollo para generar primero las tres capas germinales ( ectodermo , mesodermo y endodermo ) del embrión y los progenitores intermedios, seguidas de decisiones posteriores o puntos de control, dando lugar a todos los tejidos maduros del cuerpo. El proceso de diferenciación se puede modelar como una secuencia de decisiones binarias basadas en modelos estocásticos o probabilísticos . La biología del desarrollo y la embriología proporcionan el conocimiento básico de la diferenciación de los tipos de células a través del análisis de mutaciones , rastreo de linajes, micromanipulación de embriones y estudios de expresión génica . La diferenciación celular y la organogénesis tisular implican un conjunto limitado de vías de señalización del desarrollo . Por tanto, es posible dirigir el destino celular controlando las decisiones celulares a través de la señalización extracelular, imitando las señales de desarrollo.
Material de origen
La diferenciación dirigida se aplica principalmente a células madre pluripotentes (PSC) de origen mamífero, en particular células de ratón y humanas para aplicaciones de investigación biomédica . Desde el descubrimiento de las células madre embrionarias (ES) (1981) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) (2006), el material de origen es potencialmente ilimitado. Históricamente, también se han utilizado células de carcinoma embrionario (CE). Se han utilizado fibroblastos u otros tipos de células diferenciadas para estrategias de reprogramación directa .
Métodos
La diferenciación celular implica una transición de un modo proliferativo a un modo de diferenciación. La diferenciación dirigida consiste en imitar las decisiones de desarrollo (desarrollo del embrión) in vitro utilizando las células madre como material de origen. Para este propósito, las células madre pluripotentes (PSC) se cultivan en condiciones controladas que implican un sustrato específico o matrices extracelulares que promueven la adhesión y diferenciación celular, y definen las composiciones de los medios de cultivo . Un número limitado de factores de señalización tales como factores de crecimiento o moléculas pequeñas , que controlan la diferenciación celular, se aplica secuencialmente o de manera combinatoria, en dosis y tiempo de exposición variables . La diferenciación adecuada del tipo de célula de interés se verifica mediante el análisis de marcadores específicos del tipo de célula , el perfil de expresión génica y los ensayos funcionales.
Métodos tempranos
- cocultivo con células estromales o células alimentadoras , y en sustratos de cultivo específicos:
las células de apoyo y las matrices proporcionan señales ambientales similares al desarrollo.
- Formación de agregados de células 3D, denominados cuerpos embrioides ( EB ): el objetivo agregado es imitar el desarrollo embrionario temprano e instruir la diferenciación celular.
- cultivo en presencia de suero fetal bovino , eliminación de factores de pluripotencia.
Metodologías actuales
Diferenciación dirigida
Este método consiste en exponer las células a moduladores de vías de señalización específicas y manipular las condiciones de cultivo celular (ambientales o exógenas) para imitar la secuencia natural de decisiones de desarrollo para producir un determinado tipo de célula / tejido. Un inconveniente de este enfoque es la necesidad de tener una buena comprensión de cómo se forma el tipo de célula de interés.
Reprogramación directa
Este método, también conocido como transdiferenciación o conversión directa, consiste en sobreexpresar uno o varios factores, generalmente factores de transcripción, introducidos en las células. El material de partida puede ser células madre pluripotentes (PSC) o un tipo de célula diferenciada, como fibroblastos. El principio se demostró por primera vez en 1987 con los factores miogénicos MyoD. Un inconveniente de este enfoque es la introducción de ácido nucleico extraño en las células y la expresión forzada de factores de transcripción cuyos efectos no se comprenden completamente.
Selección específica de linaje / tipo de célula
Este método consiste en seleccionar el tipo celular de interés, generalmente con resistencia a antibióticos . Para este propósito, las células del material fuente se modifican para contener un casete de resistencia a antibióticos bajo un promotor específico del tipo de célula diana . Solo las células comprometidas con el linaje de interés sobreviven a la selección .
Aplicaciones
La diferenciación dirigida proporciona una fuente potencialmente ilimitada y manipulable de células y tejidos. Algunas aplicaciones se ven afectadas por el fenotipo inmaduro del tipo de célula derivada de células madre pluripotentes (PSC), lo que limita los estudios fisiológicos y funcionales posibles. Surgieron varios dominios de aplicación:
Sistema modelo para ciencia básica
Para las ciencias básicas , en particular la biología del desarrollo y la biología celular , las células derivadas de PSC permiten estudiar a nivel molecular y celular cuestiones fundamentales in vitro, que de otro modo habrían sido extremadamente difíciles o imposibles de estudiar por razones técnicas y éticas in vivo, como las embrionarias. desarrollo del ser humano. En particular, las células diferenciadoras son susceptibles de estudios cuantitativos y cualitativos. También se pueden estudiar procesos más complejos in vitro y se ha descrito la formación de organoides, incluidos cerebroides, copa óptica y riñón .
Descubrimiento de fármacos y toxicología
Los tipos de células diferenciadas de las células madre pluripotentes (CEP) se están evaluando como modelos preclínicos in vitro de enfermedades humanas. Los tipos de células humanas en una placa proporcionan una alternativa a los ensayos preclínicos tradicionales que utilizan células animales, humanas inmortalizadas o cultivos primarios de biopsias , que tienen sus limitaciones. Los tipos de células clínicamente relevantes, es decir, el tipo de células afectadas por enfermedades, son un foco principal de investigación, esto incluye hepatocitos , células beta de los islotes de Langerhans , cardiomiocitos y neuronas . El cribado de fármacos se realiza en cultivo celular miniaturizado en placas de pocillos múltiples o en un chip.
Modelado de enfermedades
Las células derivadas de PSC de pacientes se utilizan in vitro para recrear patologías específicas. El tipo de célula específico afectado en la patología está en la base del modelo. Por ejemplo, las motoneuronas se utilizan para estudiar la atrofia muscular espinal (SMA) y los cardiomiocitos se utilizan para estudiar la arritmia . Esto puede permitir una mejor comprensión de la patogenia y el desarrollo de nuevos tratamientos a través del descubrimiento de fármacos. Los tipos de células inmaduras derivadas de PSC se pueden madurar in vitro mediante diversas estrategias, como el envejecimiento in vitro , para modelar in vitro la enfermedad relacionada con la edad. Las principales enfermedades que se modelan con células derivadas de PSC son la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (PD), el síndrome de X frágil (FXS), la enfermedad de Huntington (HD), el síndrome de Down , la atrofia muscular espinal (AME), distrofias musculares , fibrosis quística , síndrome de QT largo , y la diabetes de tipo I .
Medicina regenerativa
La fuente potencialmente ilimitada de células y tejidos puede tener una aplicación directa para la ingeniería de tejidos , el reemplazo celular y el trasplante después de lesiones agudas y cirugía reconstructiva . Estas aplicaciones se limitan a los tipos de células que se pueden diferenciar de forma eficaz y segura de las CEP humanas con la organogénesis adecuada . Los órganos descelularizados también se están utilizando como andamio de tejido para la organogénesis. El material de origen puede ser células sanas normales de otro donante (trasplante heterólogo) o corregidas genéticamente del mismo paciente (autólogo). Se han planteado preocupaciones sobre la seguridad del paciente debido a la posibilidad de contaminar células indiferenciadas. El primer ensayo clínico que utilizó células derivadas de hESC se realizó en 2011. El primer ensayo clínico que utilizó células derivadas de hiPSC comenzó en 2014 en Japón.