Fragmentación del ADN - DNA fragmentation

La fragmentación del ADN es la separación o ruptura de hebras de ADN en pedazos. Puede ser realizado intencionalmente por personal de laboratorio o por células, o puede ocurrir de manera espontánea. La fragmentación espontánea o accidental del ADN es una fragmentación que se acumula gradualmente en una célula. Puede medirse, por ejemplo, mediante el ensayo Comet o mediante el ensayo TUNEL .

Los hombres con defectos de motilidad de los espermatozoides a menudo tienen altos niveles de fragmentación del ADN de los espermatozoides. El grado de fragmentación del ADN en los espermatozoides puede predecir los resultados de la fertilización in vitro (FIV) y su expansión por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La prueba de dispersión de cromatina espermática (SCD) y el ensayo TUNEL son eficaces para detectar daños en el ADN espermático. Usando microscopía de campo brillante , la prueba SCD parece ser más sensible que la prueba TUNEL.

Su principal unidad de medida es el índice de fragmentación del ADN (DFI). Un DFI del 20% o más reduce significativamente las tasas de éxito después de ICSI.

La fragmentación del ADN fue documentada por primera vez por Williamson en 1970 cuando observó fragmentos oligoméricos discretos que se producían durante la muerte celular en cultivos primarios de hígado neonatal. Describió el ADN citoplásmico aislado de células de hígado de ratón después de cultivo, caracterizado por fragmentos de ADN con un peso molecular que consta de múltiplos de 135 kDa . Este hallazgo fue consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear.

Intencional

La fragmentación del ADN a menudo es necesaria antes de la construcción de la biblioteca o la subclonación de secuencias de ADN. Se han empleado diversos métodos que implican la rotura mecánica del ADN cuando el personal de laboratorio fragmenta el ADN. Dichos métodos incluyen tratamiento con ultrasonidos, cizallamiento con aguja, nebulización, cizallamiento puntual y paso a través de una celda de presión.

• Restriction digest es la ruptura intencional de las hebras de ADN en el laboratorio. Es un tratamiento a base de enzimas que se utiliza en biotecnología para cortar el ADN en hebras más pequeñas con el fin de estudiar las diferencias de longitud de los fragmentos entre individuos o para la clonación de genes. Este método fragmenta el ADN mediante la escisión simultánea de ambas hebras o mediante la generación de muescas en cada hebra de dsDNA para producir roturas de dsDNA.
• Cizallamiento acústico de la transmisión de ondas de energía acústica de alta frecuencia enviadas a una biblioteca de ADN. El transductor tiene forma de cuenco para que las ondas converjan en el objetivo de interés.
• La nebulización fuerza al ADN a través de un pequeño orificio en una unidad nebulizadora , lo que da como resultado la formación de una fina niebla que se recoge. El tamaño del fragmento está determinado por la presión del gas utilizado para empujar el ADN a través del nebulizador, la velocidad a la que la solución de ADN pasa a través del orificio, la viscosidad de la solución y la temperatura.
• La sonicación , un tipo de cizallamiento hidrodinámico, somete al ADN a cavitación acústica y cizallamiento hidrodinámico por exposición a breves períodos de sonicación, que generalmente resultan en fragmentos de 700 pb. Para la fragmentación del ADN, la sonicación se aplica comúnmente en ciclos de ráfagas usando un sonicador de tipo sonda.
• El cizallamiento puntual, un tipo de cizallamiento hidrodinámico, utiliza una bomba de jeringa para crear fuerzas de cizallamiento hidrodinámicas empujando una biblioteca de ADN a través de una pequeña contracción abrupta. Aproximadamente el 90% de las longitudes de los fragmentos se encuentran dentro de un rango doble.
• El cizallamiento de la aguja crea fuerzas de cizallamiento al pasar las bibliotecas de ADN a través de una aguja de pequeño calibre. El ADN pasa a través de una aguja de calibre varias veces para romper físicamente el ADN en pedazos finos.
• Las células de presión francesa pasan el ADN a través de una válvula estrecha a alta presión para crear altas fuerzas de cizallamiento. Con una prensa francesa, la fuerza de corte se puede modular cuidadosamente ajustando la presión del pistón. La prensa proporciona una sola pasada a través del punto de máxima fuerza de corte, lo que limita el daño a las delicadas estructuras biológicas debido al corte repetido, como ocurre en otros métodos de interrupción.
• En la fragmentación (etiquetado) mediada por transposomas, los transposomas se preparan con ADN que luego se corta para que los eventos de transposición den como resultado ADN fragmentado con adaptadores (en lugar de una inserción). La concentración relativa de transposomas y ADN debe ser adecuada.

Espontáneo

La fragmentación apoptótica del ADN es una fragmentación natural que realizan las células en la apoptosis (muerte celular programada). La fragmentación del ADN es un sello bioquímico de la apoptosis . En las células moribundas, el ADN es escindido por una endonucleasa que fragmenta la cromatina en unidades nucleosomales, que son múltiplos de oligómeros de aproximadamente 180 pb y aparecen como una escalera de ADN cuando se procesan en un gel de agarosa. La enzima responsable de la fragmentación apoptótica del ADN es la ADNasa activada por caspasa . La CAD normalmente es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la DNasa activada por caspasa (ICAD) . Durante la apoptosis, el efector apoptótico caspasa, caspasa 3, escinde ICAD y, por lo tanto, hace que la CAD se active.

Un nucleosoma , que consta de ADN (gris) envuelto alrededor de un tetrámero de histona (de color). En la fragmentación apoptótica del ADN, el ADN se escinde en la región enlazadora internucleosomal , que es la parte del ADN que no se envuelve alrededor de las histonas.

CAD escinde el ADN en los sitios de enlace internucleosómico entre los nucleosomas, estructuras que contienen proteínas que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~ 180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está envuelto firmemente alrededor de las histonas, las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios de enlace son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por lo tanto, accesibles a CAD.

Usos

La fragmentación del ADN juega un papel importante en la ciencia forense, especialmente en la elaboración de perfiles de ADN .

• El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica para analizar las longitudes variables de fragmentos de ADN que resultan de digerir una muestra de ADN con una endonucleasa de restricción . La endonucleasa de restricción corta el ADN en un patrón de secuencia específico conocido como sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción. La presencia o ausencia de ciertos sitios de reconocimiento en una muestra de ADN genera fragmentos de ADN de longitudes variables, que se separan mediante electroforesis en gel . Luego se hibridan con sondas de ADN que se unen a una secuencia de ADN complementaria en la muestra.
• En el análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se hacen millones de copias exactas de ADN de una muestra biológica. Solía ​​amplificar una región específica de una hebra de ADN (el ADN objetivo). La mayoría de los métodos de PCR suelen amplificar fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kb), aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kb de tamaño. La PCR también usa calor para separar las hebras de ADN.
• El ADN fragmentado durante la apoptosis, de un tamaño de 1 a 20 nucleosomas, puede aislarse selectivamente de las células fijadas en el etanol fijador desnaturalizante.

Referencias