Agroinfiltración - Agroinfiltration
La agroinfiltración es un método utilizado en biología vegetal y especialmente últimamente en biotecnología vegetal para inducir la expresión transitoria de genes en una planta , o en hojas aisladas de una planta, o incluso en cultivos de células vegetales, con el fin de producir una proteína deseada . En el método, se introduce una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en una hoja de la planta mediante inyección directa o mediante infiltración al vacío, o se asocia con células vegetales inmovilizadas sobre un soporte poroso (paquetes de células vegetales), después de lo cual las bacterias transfieren el gen deseado al células vegetales mediante transferencia de T-DNA . El principal beneficio de la agroinfiltración en comparación con la transformación de plantas más tradicional es la velocidad y la conveniencia, aunque los rendimientos de la proteína recombinante generalmente también son más altos y más consistentes.
El primer paso es introducir un gen de interés en una cepa de Agrobacterium tumefaciens . Posteriormente, la cepa se hace crecer en un cultivo líquido y las bacterias resultantes se lavan y se suspenden en una solución tampón adecuada . Para inyección, esta solución se coloca en una jeringa (sin aguja). La punta de la jeringa se presiona contra la parte inferior de una hoja mientras se aplica simultáneamente una suave contrapresión al otro lado de la hoja. El Agrobacterium suspensión se inyecta entonces en los espacios aéreos dentro de la hoja a través de los estomas , o, a veces a través de una pequeña incisión hecha en la cara inferior de la hoja.
La infiltración al vacío es otra forma de introducir Agrobacterium profundamente en el tejido vegetal. En este procedimiento, los discos de hojas, las hojas o las plantas enteras se sumergen en un vaso de precipitados que contiene la solución y el vaso de precipitados se coloca en una cámara de vacío. Luego se aplica el vacío, forzando el aire a salir de los espacios intercelulares dentro de las hojas a través de los estomas. Cuando se libera el vacío, la diferencia de presión fuerza la suspensión de "Agrobacterium" hacia las hojas a través de los estomas hacia el tejido del mesófilo . Esto puede resultar en que casi todas las células de cualquier hoja estén en contacto con la bacteria.
Una vez dentro de la hoja, el Agrobacterium permanece en el espacio intercelular y transfiere el gen de interés como parte del ADN-T derivado del plásmido Ti en un alto número de copias a las células de la planta. La transferencia de genes ocurre cuando se inducen las señales de la planta y se establece un contacto físico entre las células de la planta y la bacteria. La bacteria crea un mecanismo que hace un agujero y transfiere la nueva hebra de ADN-T a la célula vegetal. El T-DNA se mueve hacia el núcleo de la planta y comienza a integrarse en el cromosoma de las plantas. A continuación, el gen se expresa transitoriamente a través de la síntesis de ARN a partir de secuencias promotoras apropiadas en todas las células transfectadas (no se realiza ninguna selección para una integración estable). La planta puede controlarse para detectar un posible efecto en el fenotipo , someterse a condiciones experimentales o recolectarse y usarse para la purificación de la proteína de interés. Muchas especies de plantas se pueden procesar con este método, pero las más comunes son Nicotiana benthamiana y, con menos frecuencia, Nicotiana tabacum .
La expresión transitoria en paquetes de células vegetales cultivadas es un nuevo procedimiento, recientemente patentado por el Fraunhofer Institute IVV, Alemania. Para esta técnica, las células de tabaco cultivadas en suspensión (p. Ej., Líneas celulares NT1 o BY2 de Nicotiana tabacum ) se inmovilizan mediante filtración sobre un soporte poroso para formar un paquete celular bien aireado, luego se incuban con Agrobacterium recombinante durante un tiempo para permitir que T- Transferencia de ADN, antes de la refiltración para eliminar el exceso de bacterias y líquido. La incubación del paquete celular en un ambiente húmedo durante períodos de tiempo de hasta varios días permite la expresión transitoria de proteínas. Las proteínas secretadas pueden eliminarse por lavado del paquete celular mediante la aplicación de tampón y una filtración adicional.
Supresores silenciadores en agroinfiltración
Es bastante común cofiltrar el Agrobacterium que lleva el constructo de interés junto con otro Agrobacterium que lleva un gen de la proteína supresora del silenciamiento, como el que codifica la proteína p19 del virus del achaparramiento tupido del tomate (TBSV), patógeno para las plantas , o la proteína NS de la marchitez del tomate. virus (TSWV). El TBSV se descubrió por primera vez en 1935 en tomates y da como resultado plantas con retraso en el crecimiento y frutos deformados. El TSWV se descubrió en tomates en Australia en 1915, y durante muchos años fue el único miembro de lo que ahora se conoce como género Tospovirus , familia Bunyaviridae .
Para defenderse de los virus y otros patógenos que introducen ácidos nucleicos extraños en sus células, las plantas han desarrollado un sistema de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) en el que se producen pequeños ARN interferentes a partir de ARN bicatenario para crear una secuencia. vía de degradación específica que silencia eficazmente genes no nativos. Muchos virus de plantas han desarrollado mecanismos que contrarrestan los sistemas de PTGS de las plantas mediante la evolución de proteínas, como p19 y NS, que interfieren con la vía de PTGS a diferentes niveles.
Aunque no está claro exactamente cómo funciona p19 para suprimir el silenciamiento del ARN, los estudios han demostrado que las proteínas expresadas de forma transitoria en las hojas de Nicotiana benthamiana tienen un rendimiento hasta 50 veces mayor cuando se coinfiltran con TBSV p19.
Se ha demostrado que el TSWV y otras proteínas NS de tospovirus son eficaces como supresores del silenciamiento tanto local como sistémico, y pueden ser una alternativa útil a p19 cuando se ha demostrado que esta última no es eficaz. En otros estudios, se ha demostrado que p19 del virus arrugado moteado de alcachofa tiene un efecto similar, aunque más débil, al p19 de TBSV.