Microscopio 4Pi - 4Pi microscope
Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . Con él, el rango típico de la resolución axial de 500 a 700 nm se puede mejorar a 100 a 150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con 5 a 7 veces menos volumen que el de la microscopía confocal estándar .
Principio de funcionamiento
La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes de objetivo opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud de la trayectoria óptica a través de cada uno de los dos objetivos se alinea cuidadosamente para que sea mínima. Mediante este método, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos pueden iluminarse coherentemente desde ambos lados y la luz reflejada o emitida también puede recogerse coherentemente, es decir, es posible una superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se acerca a su máximo. En este caso, la muestra se ilumina y se detecta desde todos los lados simultáneamente.
El modo de funcionamiento de un microscopio 4Pi se muestra en la figura. La luz láser está dividida por un divisor de haz y dirigida por espejos hacia las dos lentes objetivas opuestas. En el punto focal común se produce la superposición de ambos haces de luz enfocados. Las moléculas excitadas en esta posición emiten luz de fluorescencia, que es recogida por ambos objetivos, combinada por el mismo divisor de haz y desviada por un espejo dicroico hacia un detector. Allí puede volver a producirse la superposición de ambas vías de luz emitidas.
En el caso ideal, cada lente objetivo puede captar luz desde un ángulo sólido de . Con dos lentes de objetivo, se puede captar desde todas las direcciones (ángulo sólido ). El nombre de este tipo de microscopía se deriva del ángulo sólido máximo posible para la excitación y la detección. Prácticamente, solo se pueden lograr ángulos de apertura de aproximadamente 140 ° para una lente de objetivo, lo que corresponde a .
El microscopio se puede operar de tres formas diferentes: En un microscopio 4Pi de tipo A, la superposición coherente de luz de excitación se utiliza para generar el aumento de resolución. La luz de emisión se detecta solo desde un lado o en una superposición incoherente desde ambos lados. En un microscopio 4Pi de tipo B, solo interfiere la luz de emisión. Cuando se opera en el modo de tipo C, se permite que tanto la luz de excitación como la de emisión interfieran, lo que lleva al aumento de resolución más alto posible (~ 7 veces a lo largo del eje óptico en comparación con la microscopía confocal).
En un microscopio de 4Pi real, la luz no se puede aplicar o recolectar desde todas las direcciones por igual, lo que lleva a los llamados lóbulos laterales en la función de dispersión de puntos . Normalmente (pero no siempre) se usa microscopía de excitación de dos fotones en un microscopio de 4Pi en combinación con un orificio de emisión para bajar estos lóbulos laterales a un nivel tolerable.
Historia
En 1971, Christoph Cremer y Thomas Cremer propusieron la creación de un holograma perfecto , es decir, uno que lleva toda la información de campo de la emisión de una fuente puntual en todas las direcciones, un llamado holograma. Sin embargo, la publicación de 1978 había sacado una conclusión física inadecuada (es decir, un punto de luz similar a un punto) y había pasado por alto por completo el aumento de la resolución axial como el beneficio real de agregar el otro lado del ángulo sólido. La primera descripción de un sistema practicable de microscopía 4Pi, es decir, la configuración con dos lentes interferentes opuestos, fue inventada por Stefan Hell en 1991. Lo demostró experimentalmente en 1994.
En los años siguientes, el número de aplicaciones de este microscopio ha crecido. Por ejemplo, la excitación y detección paralelas con 64 puntos en la muestra, combinadas simultáneamente con la resolución espacial mejorada, dieron como resultado el registro exitoso de la dinámica de las mitocondrias en células de levadura con un microscopio 4Pi en 2002. El fabricante de microscopios Leica Microsystems lanzó una versión comercial. en 2004 y posteriormente descontinuado.
Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se alcanzaba junto con técnicas de superresolución como el principio de agotamiento de la emisión estimulada (STED). Usando un microscopio 4Pi con haces de excitación y desexcitación apropiados, fue posible crear un punto de tamaño uniforme de 50 nm, que corresponde a un volumen focal disminuido en comparación con la microscopía confocal en un factor de 150-200 en células fijas. Con la combinación de microscopía 4Pi y microscopía RESOLFT con proteínas intercambiables , ahora es posible tomar imágenes de células vivas a bajos niveles de luz con resoluciones isotrópicas por debajo de 40 nm.