Cromosoma artificial de levadura - Yeast artificial chromosome

Este artículo trata sobre los cromosomas derivados del ADN de levadura. Para la levadura creada a partir de ADN sintético, consulte ADN sintético .

Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son cromosomas modificados genéticamente derivados del ADN de la levadura, Saccharomyces cerevisiae , que luego se liga en un plásmido bacteriano. Al insertar grandes fragmentos de ADN, de 100 a 1000 kb, las secuencias insertadas pueden clonarse y mapearse físicamente mediante un proceso llamado caminata cromosómica . Este es el proceso que se utilizó inicialmente para el Proyecto Genoma Humano ; sin embargo, debido a problemas de estabilidad, los YAC fueron abandonados para el uso de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) . A partir de la investigación inicial de Rankin et al., Strul et al., Y Hsaio et al., El cromosoma inherentemente frágil se estabilizó mediante el descubrimiento de la secuencia de replicación autónoma (ARS) necesaria; un YAC refinado que utiliza estos datos fue descrito en 1983 por Murray et al.

Los componentes principales de un YAC son el ARS, el centrómero y los telómeros de S. cerevisiae . Además, se utilizan genes marcadores seleccionables, como la resistencia a antibióticos y un marcador visible, para seleccionar células de levadura transformadas. Sin estas secuencias, el cromosoma no será estable durante la replicación extracelular y no sería distinguible de las colonias sin el vector.

Esta es una foto de dos copias de la Biblioteca YAC del Genoma Humano de la Universidad de Washington. Cada una de las pilas tiene aproximadamente 12 placas de microtitulación. Cada placa tiene 96 pocillos, cada uno con diferentes clones de levadura.

Construcción

Un YAC se construye usando un plásmido de ADN circular inicial , que típicamente se corta en una molécula de ADN lineal usando enzimas de restricción ; Luego, la ADN ligasa se usa para ligar una secuencia de ADN o un gen de interés en el ADN linealizado, formando una sola pieza circular grande de ADN. La generación básica de cromosomas artificiales de levadura lineal se puede dividir en 6 pasos principales:

  1. Ligadura de marcador seleccionable en vector plásmido: esto permite la selección diferencial de colonias con o sin el gen marcador. Un gen de resistencia a antibióticos permite amplificar y seleccionar el vector YAC en E. coli rescatando la capacidad de E. coli mutante para sintetizar leucina en presencia de los componentes necesarios dentro del medio de crecimiento. Los genes TRP1 y URA3 son otros marcadores seleccionables. El sitio de clonación del vector YAC para el ADN extraño se encuentra dentro del gen SUP4 . Este gen compensa una mutación en la célula huésped de la levadura que provoca la acumulación de pigmento rojo. Las células huésped son normalmente rojas, y aquellas transformadas con YAC solamente, formarán colonias incoloras. La clonación de un fragmento de ADN extraño en el YAC provoca la inactivación por inserción del gen, restaurando el color rojo. Por lo tanto, las colonias que contienen el fragmento de ADN extraño son rojas.
  2. Ligadura de secuencias centroméricas necesarias para la estabilidad mitótica
  3. Ligación de secuencias de replicación autónoma (ARS) que proporciona un origen de replicación para experimentar la replicación mitótica. Esto permite que el plásmido se replique extracromosómicamente, pero hace que el plásmido sea altamente mitóticamente inestable y se pierda fácilmente sin las secuencias centroméricas.
  4. Ligadura de secuencias teloméricas artificiales para convertir un plásmido circular en una pieza lineal de ADN.
  5. Inserción de la secuencia de ADN a amplificar (hasta 1000 kb)
  6. Colonia de levadura de transformación

Cromosoma III completo

En marzo de 2014, Jef Boeke, del Langone Medical Center de la Universidad de Nueva York, publicó que su equipo sintetizó uno de los 16 cromosomas de levadura de S. cerevisiae , el cromosoma III, que denominó synIII . El procedimiento implicó reemplazar los genes en el cromosoma original con versiones sintéticas y luego el cromosoma sintetizado terminado se integró en una célula de levadura. Se requirió diseñar y crear 273,871 pares de bases de ADN, menos que los 316,667 pares del cromosoma original.

Usos en biotecnología

Los vectores de expresión de levadura, como YAC, YIps (plásmidos integradores de levadura) y YEps (plásmidos episomales de levadura), tienen una ventaja sobre los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) en que pueden usarse para expresar proteínas eucariotas que requieren modificación postraduccional . Al poder insertar grandes fragmentos de ADN, los YAC se pueden utilizar para clonar y ensamblar los genomas completos de un organismo. Con la inserción de un YAC en células de levadura, se pueden propagar como cromosomas artificiales lineales, clonando las regiones insertadas de ADN en el proceso. Con esto completado, se pueden usar dos procesos para obtener un genoma secuenciado o región de interés:

  1. Mapeo físico
  2. Cromosoma caminando

Esto es significativo porque permite el mapeo detallado de regiones específicas del genoma. Se han examinado cromosomas humanos completos, como el cromosoma X, generando la ubicación de marcadores genéticos para numerosos trastornos y rasgos genéticos.

Esquema del plásmido pBR322 generado en el Laboratorio Boyer en UC San Francisco por Bolívar y Rodríguez en 1972. Es uno de los primeros y más utilizados vectores, y la base para los YAC creados por Murray y Szostak en 1983 El plásmido contiene ampicilina y genes de resistencia a tetraciclina, y un conjunto de sitios diana de enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN.

El proyecto del genoma humano

Los YAC son significativamente menos estables que los BAC y producen "efectos quiméricos": artefactos en los que la secuencia del ADN clonado en realidad no corresponde a una sola región genómica sino a múltiples regiones. El quimerismo puede deberse a la co-ligación de múltiples segmentos genómicos en un solo YAC, o a la recombinación de dos o más YAC transformados en la misma célula de levadura huésped. La incidencia de quimerismo puede llegar al 50%. Otros artefactos son la deleción de segmentos de una región clonada y el reordenamiento de segmentos genómicos (como la inversión). En todos estos casos, la secuencia determinada a partir del clon YAC es diferente de la secuencia natural original, lo que conduce a resultados inconsistentes y errores de interpretación si se confía en la información del clon. Debido a estos problemas, el Proyecto Genoma Humano finalmente abandonó el uso de YAC y cambió a cromosomas artificiales bacterianos , donde la incidencia de estos artefactos es muy baja. Además de los problemas de estabilidad, específicamente la ocurrencia relativamente frecuente de eventos quiméricos, los YAC demostraron ser ineficaces al generar la ruta de mosaico mínima que cubre todo el genoma humano. Generar las bibliotecas de clones requiere mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza de la dependencia de los sitios etiquetados en secuencia (STS) como punto de referencia al seleccionar los clones apropiados, existen grandes lagunas que necesitan una mayor generación de bibliotecas para abarcar. Es este obstáculo adicional el que llevó al proyecto a utilizar BAC en su lugar. Esto se debe a dos factores:

  1. Los BAC son mucho más rápidos de generar, y cuando se generan bibliotecas redundantes de clones, esto es esencial.
  2. Los BAC permiten una cobertura más densa con STS, lo que da como resultado trayectorias de mosaico mínimo más completas y eficientes generadas in silico.

Sin embargo, es posible utilizar ambos enfoques, como se demostró cuando el genoma del nematodo C. elegans . La mayoría del genoma estaba en mosaico con BAC, y los vacíos se rellenaron con YAC.

Ver también

Referencias

enlaces externos