Cristalografía de rayos X - X-ray crystallography

Cristalografía de rayos X ( XRC ) es la ciencia experimental determinar la estructura atómica y molecular de un cristal , en el que la estructura cristalina hace que un haz de incidentes rayos X a difractan en muchas direcciones específicas. Al medir los ángulos e intensidades de estos haces difractados, un cristalógrafo puede producir una imagen tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal. A partir de esta densidad de electrones , se pueden determinar las posiciones medias de los átomos en el cristal, así como sus enlaces químicos , su desorden cristalográfico y otra información diversa.

Dado que muchos materiales pueden formar cristales, como sales , metales , minerales , semiconductores , así como varias moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas, la cristalografía de rayos X ha sido fundamental en el desarrollo de muchos campos científicos. En sus primeras décadas de uso, este método determinó el tamaño de los átomos, las longitudes y tipos de enlaces químicos y las diferencias de escala atómica entre varios materiales, especialmente minerales y aleaciones . El método también reveló la estructura y función de muchas moléculas biológicas, incluidas vitaminas , fármacos, proteínas y ácidos nucleicos como el ADN . La cristalografía de rayos X sigue siendo el método principal para caracterizar la estructura atómica de nuevos materiales y para discernir materiales que parecen similares en otros experimentos . Las estructuras cristalinas de rayos X también pueden explicar las propiedades electrónicas o elásticas inusuales de un material, arrojar luz sobre las interacciones y procesos químicos, o servir como base para diseñar productos farmacéuticos contra enfermedades .

En una medición de difracción de rayos X de monocristal, se monta un cristal en un goniómetro . El goniómetro se utiliza para colocar el cristal en orientaciones seleccionadas. El cristal se ilumina con un haz monocromático de rayos X finamente enfocado , produciendo un patrón de difracción de puntos regularmente espaciados conocidos como reflejos . Las imágenes bidimensionales tomadas en diferentes orientaciones se convierten en un modelo tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal utilizando el método matemático de transformadas de Fourier , combinado con datos químicos conocidos de la muestra. Puede producirse una resolución deficiente (borrosidad) o incluso errores si los cristales son demasiado pequeños o no lo suficientemente uniformes en su composición interna.

La cristalografía de rayos X está relacionada con varios otros métodos para determinar las estructuras atómicas. Se pueden producir patrones de difracción similares mediante la dispersión de electrones o neutrones , que también se interpretan mediante la transformación de Fourier . Si no se pueden obtener monocristales de tamaño suficiente, se pueden aplicar otros métodos de rayos X para obtener información menos detallada; tales métodos incluyen difracción de fibra , difracción de polvo y (si la muestra no está cristalizada) dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). Si el material bajo investigación solo está disponible en forma de polvos nanocristalinos o tiene poca cristalinidad, se pueden aplicar los métodos de cristalografía electrónica para determinar la estructura atómica.

Para todos los métodos de difracción de rayos X mencionados anteriormente, la dispersión es elástica ; los rayos X dispersos tienen la misma longitud de onda que los rayos X entrantes. Por el contrario, los métodos de dispersión de rayos X inelásticos son útiles para estudiar las excitaciones de la muestra, como los plasmones , el campo cristalino y las excitaciones orbitales, magnones y fonones , más que la distribución de sus átomos.

Historia

Historia científica temprana de cristales y rayos X

Dibujo de empaquetadura cuadrada (Figura A, arriba) y hexagonal (Figura B, abajo) de la obra de Kepler , Strena seu de Nive Sexangula .

Los cristales, aunque admirados durante mucho tiempo por su regularidad y simetría, no se investigaron científicamente hasta el siglo XVII. Johannes Kepler planteó la hipótesis en su obra Strena seu de Nive Sexangula (Un regalo de año nuevo de nieve hexagonal) (1611) de que la simetría hexagonal de los cristales de copo de nieve se debía a un empaquetamiento regular de partículas esféricas de agua.

Como muestra la cristalografía de rayos X, la simetría hexagonal de los copos de nieve resulta de la disposición tetraédrica de los enlaces de hidrógeno alrededor de cada molécula de agua. Las moléculas de agua están dispuestas de manera similar a los átomos de silicio en el polimorfo de tridimita de SiO 2 . La estructura cristalina resultante tiene simetría hexagonal cuando se ve a lo largo de un eje principal.

El científico danés Nicolas Steno (1669) fue pionero en las investigaciones experimentales de la simetría cristalina. Steno demostró que los ángulos entre las caras son los mismos en cada ejemplar de un tipo particular de cristal, y René Just Haüy (1784) descubrió que cada cara de un cristal puede describirse mediante patrones simples de apilamiento de bloques de la misma forma y tamaño. . Por lo tanto, William Hallowes Miller en 1839 pudo dar a cada cara una etiqueta única de tres pequeños enteros, los índices de Miller que siguen en uso hoy en día para identificar las caras de los cristales. El estudio de Haüy llevó a la idea correcta de que los cristales son una matriz tridimensional regular (una red de Bravais ) de átomos y moléculas ; una sola celda unitaria se repite indefinidamente a lo largo de tres direcciones principales que no son necesariamente perpendiculares. En el siglo XIX, Johan Hessel , Auguste Bravais , Evgraf Fedorov , Arthur Schönflies y (tardíamente) William Barlow (1894) elaboraron un catálogo completo de las posibles simetrías de un cristal . A partir de los datos disponibles y el razonamiento físico, Barlow propuso varias estructuras cristalinas en la década de 1880 que fueron validadas más tarde por cristalografía de rayos X; sin embargo, los datos disponibles eran demasiado escasos en la década de 1880 para aceptar sus modelos como concluyentes.

La cristalografía de rayos X muestra la disposición de las moléculas de agua en el hielo, revelando los enlaces de hidrógeno (1) que mantienen unido el sólido. Pocos otros métodos pueden determinar la estructura de la materia con tanta precisión ( resolución ).

Wilhelm Röntgen descubrió los rayos X en 1895, justo cuando se estaban completando los estudios de simetría cristalina. Los físicos no estaban seguros de la naturaleza de los rayos X, pero pronto sospecharon que eran ondas de radiación electromagnética , una forma de luz . La teoría de Maxwell de la radiación electromagnética fue bien aceptada entre los científicos, y los experimentos de Charles Glover Barkla mostraron que los rayos X exhibían fenómenos asociados con ondas electromagnéticas, incluida la polarización transversal y líneas espectrales similares a las observadas en las longitudes de onda visibles. Los experimentos de una sola rendija en el laboratorio de Arnold Sommerfeld sugirieron que los rayos X tenían una longitud de onda de aproximadamente 1 angstrom . Los rayos X no solo son ondas, sino que también son fotones y tienen propiedades de partículas. Albert Einstein introdujo el concepto de fotón en 1905, pero no fue ampliamente aceptado hasta 1922, cuando Arthur Compton lo confirmó mediante la dispersión de rayos X de electrones. Las propiedades de partículas de los rayos X, como la ionización de los gases, llevaron a William Henry Bragg a argumentar en 1907 que los rayos X no eran radiación electromagnética. La opinión de Bragg resultó impopular y la observación de la difracción de rayos X por Max von Laue en 1912 confirmó para la mayoría de los científicos que los rayos X son una forma de radiación electromagnética.

difracción de rayos X

El rayo entrante (procedente de la parte superior izquierda) hace que cada dispersor vuelva a irradiar una pequeña parte de su intensidad como una onda esférica. Si los dispersores están dispuestos simétricamente con una separación d , estas ondas esféricas estarán sincronizadas (se sumarán constructivamente) solo en direcciones donde su diferencia de longitud de trayectoria 2 d sen θ es igual a un múltiplo entero de la longitud de onda λ. En ese caso, parte del haz entrante se desvía en un ángulo 2θ, produciendo un punto de reflexión en el patrón de difracción .

Los cristales son conjuntos regulares de átomos y los rayos X pueden considerarse ondas de radiación electromagnética. Los átomos dispersan ondas de rayos X, principalmente a través de los electrones de los átomos. Así como una ola del océano que golpea un faro produce ondas circulares secundarias que emanan del faro, un rayo X que golpea un electrón produce ondas esféricas secundarias que emanan del electrón. Este fenómeno se conoce como dispersión elástica , y el electrón (o faro) se conoce como dispersor . Una matriz regular de dispersores produce una matriz regular de ondas esféricas. Aunque estas ondas se cancelan entre sí en la mayoría de las direcciones a través de una interferencia destructiva , se suman constructivamente en algunas direcciones específicas, determinadas por la ley de Bragg :

Aquí d es el espacio entre planos de difracción, es el ángulo de incidencia, n es cualquier número entero y λ es la longitud de onda del haz. Estas direcciones específicas aparecen como puntos en el patrón de difracción llamados reflejos . Por lo tanto, la difracción de rayos X es el resultado de una onda electromagnética (los rayos X) que incide en una matriz regular de dispersores (la disposición repetida de átomos dentro del cristal).

Los rayos X se utilizan para producir el patrón de difracción porque su longitud de onda λ es típicamente del mismo orden de magnitud (1–100 angstroms) que el espaciado d entre planos en el cristal. En principio, cualquier onda que incida en un conjunto regular de dispersores produce difracción , como lo predijo Francesco Maria Grimaldi en 1665. Para producir una difracción significativa, el espacio entre los dispersores y la longitud de onda de la onda que incide debe ser de tamaño similar. A modo de ilustración, James Gregory informó por primera vez de la difracción de la luz solar a través de la pluma de un pájaro a finales del siglo XVII. Las primeras rejillas de difracción artificial para luz visible fueron construidas por David Rittenhouse en 1787 y Joseph von Fraunhofer en 1821. Sin embargo, la luz visible tiene una longitud de onda demasiado larga (típicamente, 5500 angstroms) para observar la difracción de los cristales. Antes de los primeros experimentos de difracción de rayos X, no se conocían con certeza las distancias entre los planos de la red en un cristal.

La idea de que los cristales pudieran usarse como una rejilla de difracción para rayos X surgió en 1912 en una conversación entre Paul Peter Ewald y Max von Laue en el Jardín Inglés de Munich . Ewald había propuesto un modelo de resonador de cristales para su tesis, pero este modelo no se pudo validar usando luz visible , ya que la longitud de onda era mucho mayor que el espacio entre los resonadores. Von Laue se dio cuenta de que se necesitaba radiación electromagnética de una longitud de onda más corta para observar espaciamientos tan pequeños, y sugirió que los rayos X podrían tener una longitud de onda comparable al espaciamiento de celda unitaria en los cristales. Von Laue trabajó con dos técnicos, Walter Friedrich y su asistente Paul Knipping, para hacer brillar un haz de rayos X a través de un cristal de sulfato de cobre y registrar su difracción en una placa fotográfica . Después de ser revelada, la placa mostró una gran cantidad de puntos bien definidos dispuestos en un patrón de círculos que se cruzan alrededor del punto producido por el haz central. Von Laue desarrolló una ley que conecta los ángulos de dispersión y el tamaño y la orientación de los espacios de las celdas unitarias en el cristal, por lo que fue galardonado con el Premio Nobel de Física en 1914.

Dispersión

Como se describe en la derivación matemática a continuación , la dispersión de rayos X está determinada por la densidad de electrones dentro del cristal. Dado que la energía de un rayo X es mucho mayor que la de un electrón de valencia, la dispersión puede modelarse como la dispersión de Thomson , la interacción de un rayo electromagnético con un electrón libre. Este modelo se adopta generalmente para describir la polarización de la radiación dispersa.

La intensidad de la dispersión de Thomson para una partícula con masa my carga elemental q es:

Por tanto, los núcleos atómicos, que son mucho más pesados ​​que un electrón, contribuyen de manera insignificante a los rayos X dispersos.

Desarrollo de 1912 a 1920

Aunque los diamantes (arriba a la izquierda) y el grafito (arriba a la derecha) son idénticos en composición química, siendo ambos carbono puro , la cristalografía de rayos X reveló que la disposición de sus átomos (abajo) explica sus diferentes propiedades. En el diamante, los átomos de carbono están dispuestos tetraédricamente y se mantienen unidos por enlaces covalentes simples , lo que lo hace fuerte en todas las direcciones. Por el contrario, el grafito se compone de hojas apiladas. Dentro de la hoja, la unión es covalente y tiene simetría hexagonal, pero no hay enlaces covalentes entre las hojas, lo que hace que el grafito sea fácil de dividir en escamas.

Después de la investigación pionera de Von Laue, el campo se desarrolló rápidamente, sobre todo por los físicos William Lawrence Bragg y su padre William Henry Bragg . En 1912-1913, el joven Bragg desarrolló la ley de Bragg , que conecta la dispersión observada con reflejos de planos uniformemente espaciados dentro del cristal. Los Bragg, padre e hijo, compartieron el Premio Nobel de Física de 1915 por su trabajo en cristalografía. Las primeras estructuras eran generalmente simples y estaban marcadas por una simetría unidimensional. Sin embargo, a medida que los métodos computacionales y experimentales mejoraron durante las próximas décadas, se volvió factible deducir posiciones atómicas confiables para arreglos bidimensionales y tridimensionales más complicados de átomos en la celda unitaria.

El potencial de la cristalografía de rayos X para determinar la estructura de moléculas y minerales, que entonces solo se conocía vagamente a partir de experimentos químicos e hidrodinámicos, se hizo realidad de inmediato. Las primeras estructuras eran simples cristales y minerales inorgánicos, pero incluso éstos revelaron leyes fundamentales de la física y la química. La primera estructura de resolución atómica que se "resolvió" (es decir, se determinó) en 1914 fue la de la sal de mesa . La distribución de electrones en la estructura de la sal de mesa mostró que los cristales no están compuestos necesariamente por moléculas unidas covalentemente y demostró la existencia de compuestos iónicos . La estructura del diamante se resolvió en el mismo año, lo que demuestra la disposición tetraédrica de sus enlaces químicos y muestra que la longitud del enlace simple C – C era de 1,52 angstroms. Otras estructuras tempranas incluyeron cobre , fluoruro de calcio (CaF 2 , también conocido como fluorita ), calcita (CaCO 3 ) y pirita (FeS 2 ) en 1914; espinela (MgAl 2 O 4 ) en 1915; las formas rutilo y anatasa del dióxido de titanio (TiO 2 ) en 1916; pirocroita Mn (OH) 2 y, por extensión, brucita Mg (OH) 2 en 1919. También en 1919, el nitrato de sodio (NaNO 3 ) y el dicloroyoduro de cesio (CsICl 2 ) fueron determinados por Ralph Walter Graystone Wyckoff , y la wurtzita (hexagonal ZnS) se conoció en 1920.

La estructura del grafito se resolvió en 1916 mediante el método relacionado de difracción de polvo , que fue desarrollado por Peter Debye y Paul Scherrer e, independientemente, por Albert Hull en 1917. La estructura del grafito se determinó a partir de difracción monocristalina en 1924 por dos grupos de forma independiente. Hull también utilizó el método del polvo para determinar las estructuras de varios metales, como el hierro y el magnesio.

Importancia cultural y estética

En 1951, el Festival Pattern Group en el Festival de Gran Bretaña acogió a un grupo colaborativo de fabricantes textiles y cristalógrafos experimentados para diseñar encajes y estampados basados ​​en la cristalografía de rayos X de insulina , arcilla china y hemoglobina . Una de las principales científicas del proyecto fue la Dra. Helen Megaw (1907-2002), subdirectora de investigación del Laboratorio Cavendish de Cambridge en ese momento. A Megaw se le atribuye como una de las figuras centrales que se inspiró en los diagramas de cristal y vio su potencial en el diseño. En 2008, la Wellcome Collection de Londres organizó una exposición sobre el Festival Pattern Group llamada "From Atom to Patterns".

Contribuciones a la química y la ciencia de los materiales

La cristalografía de rayos X ha permitido comprender mejor los enlaces químicos y las interacciones no covalentes . Los estudios iniciales revelaron los radios típicos de los átomos y confirmaron muchos modelos teóricos de enlaces químicos, como el enlace tetraédrico del carbono en la estructura del diamante, el enlace octaédrico de metales observado en el hexacloroplatinato de amonio (IV) y la resonancia observada en la estructura del diamante. grupo carbonato plano y en moléculas aromáticas. La estructura de 1928 de Kathleen Lonsdale del hexametilbenceno estableció la simetría hexagonal del benceno y mostró una clara diferencia en la longitud del enlace entre los enlaces C-C alifáticos y los enlaces C-C aromáticos; este hallazgo llevó a la idea de resonancia entre enlaces químicos, que tuvo profundas consecuencias para el desarrollo de la química. Sus conclusiones fueron anticipadas por William Henry Bragg , quien publicó modelos de naftaleno y antraceno en 1921 basados ​​en otras moléculas, una forma temprana de reemplazo molecular .

También en la década de 1920, Victor Moritz Goldschmidt y más tarde Linus Pauling desarrollaron reglas para eliminar estructuras químicamente improbables y para determinar los tamaños relativos de los átomos. Estas reglas condujeron a la estructura de brookita (1928) y una comprensión de la estabilidad relativa de las formas rutilo , brookita y anatasa del dióxido de titanio .

La distancia entre dos átomos enlazados es una medida sensible de la fuerza del enlace y su orden de enlace ; así, los estudios cristalográficos de rayos X han conducido al descubrimiento de tipos de enlaces aún más exóticos en la química inorgánica , como los dobles enlaces metal-metal, los enlaces cuádruples metal-metal y los enlaces de dos electrones de tres centros. La cristalografía de rayos X —o, estrictamente hablando, un experimento de dispersión de Compton inelástica— también ha proporcionado evidencia del carácter parcialmente covalente de los enlaces de hidrógeno . En el campo de la química organometálica , la estructura de rayos X del ferroceno inició los estudios científicos de los compuestos sándwich , mientras que la de la sal de Zeise estimuló la investigación de los complejos "back bonding" y metal-pi. Finalmente, la cristalografía de rayos X tuvo un papel pionero en el desarrollo de la química supramolecular , particularmente en la clarificación de las estructuras de los éteres corona y los principios de la química huésped-huésped .

La difracción de rayos X es una herramienta muy poderosa en el desarrollo de catalizadores . Las mediciones ex situ se llevan a cabo de forma rutinaria para comprobar la estructura cristalina de los materiales o para desentrañar nuevas estructuras. Los experimentos in situ brindan una comprensión completa de la estabilidad estructural de los catalizadores en condiciones de reacción.

En las ciencias de los materiales, se han analizado muchos sistemas inorgánicos y organometálicos complicados utilizando métodos monocristalinos, como fullerenos , metaloporfirinas y otros compuestos complicados. La difracción monocristalina también se utiliza en la industria farmacéutica debido a problemas recientes con los polimorfos . Los principales factores que afectan la calidad de las estructuras monocristalinas son el tamaño y la regularidad del cristal; La recristalización es una técnica comúnmente utilizada para mejorar estos factores en cristales de moléculas pequeñas. La base de datos estructural de Cambridge contiene más de 1.000.000 de estructuras a junio de 2019; más del 99% de estas estructuras se determinaron mediante difracción de rayos X.

Mineralogía y metalurgia

Primera vista de difracción de rayos X del suelo marciano : el análisis CheMin revela feldespato , piroxenos , olivino y más ( rover Curiosity en " Rocknest ", 17 de octubre de 2012).

Desde la década de 1920, la difracción de rayos X ha sido el método principal para determinar la disposición de los átomos en minerales y metales . La aplicación de la cristalografía de rayos X a la mineralogía comenzó con la estructura del granate , que fue determinada en 1924 por Menzer. En la década de 1920 se llevó a cabo un estudio cristalográfico de rayos X sistemático de los silicatos . Este estudio mostró que, a medida que se altera la relación Si / O , los cristales de silicato exhiben cambios significativos en sus arreglos atómicos. Machatschki amplió estos conocimientos a los minerales en los que el aluminio sustituye a los átomos de silicio de los silicatos. La primera aplicación de la cristalografía de rayos X a la metalurgia también ocurrió a mediados de la década de 1920. En particular, la estructura de Linus Pauling de la aleación Mg 2 Sn llevó a su teoría de la estabilidad y estructura de los cristales iónicos complejos.

El 17 de octubre de 2012, el rover Curiosity en el planeta Marte en " Rocknest " realizó el primer análisis de difracción de rayos X del suelo marciano . Los resultados del analizador CheMin del rover revelaron la presencia de varios minerales, incluidos feldespato , piroxenos y olivino , y sugirieron que el suelo marciano de la muestra era similar a los " suelos basálticos erosionados " de los volcanes hawaianos .

Primeras moléculas orgánicas y biológicas pequeñas.

La estructura tridimensional de la penicilina , resuelta por Dorothy Crowfoot Hodgkin en 1945. Las esferas verde, roja, amarilla y azul representan átomos de carbono , oxígeno , azufre y nitrógeno , respectivamente. Las esferas blancas representan hidrógeno , que se determinó matemáticamente en lugar de mediante análisis de rayos X.

La primera estructura de un compuesto orgánico, la hexametilentetramina , se resolvió en 1923. A esto le siguieron varios estudios de ácidos grasos de cadena larga , que son un componente importante de las membranas biológicas . En la década de 1930, las estructuras de moléculas mucho más grandes con complejidad bidimensional comenzaron a resolverse. Un avance significativo fue la estructura de la ftalocianina , una gran molécula plana que está estrechamente relacionada con las moléculas de porfirina importantes en biología, como el hemo , la corrina y la clorofila .

La cristalografía de rayos X de moléculas biológicas despegó con Dorothy Crowfoot Hodgkin , quien resolvió las estructuras del colesterol (1937), penicilina (1946) y vitamina B 12 (1956), por lo que recibió el Premio Nobel de Química en 1964. En 1969, logró resolver la estructura de la insulina , en la que trabajó durante más de treinta años.

Cristalografía macromolecular biológica

Diagrama de cinta de la estructura de la mioglobina , que muestra hélices alfa coloreadas . Estas proteínas son moléculas largas y lineales con miles de átomos; sin embargo, la posición relativa de cada átomo se ha determinado con resolución subatómica mediante cristalografía de rayos X. Dado que es difícil visualizar todos los átomos a la vez, la cinta muestra el camino aproximado de la columna vertebral de la proteína desde su extremo N-terminal (azul) hasta su extremo C-terminal (rojo).

Las estructuras cristalinas de las proteínas (que son irregulares y cientos de veces más grandes que el colesterol) comenzaron a resolverse a fines de la década de 1950, comenzando con la estructura de la mioglobina de cachalote de Sir John Cowdery Kendrew , por la que compartió el Premio Nobel de Química con Max. Perutz en 1962. Desde ese éxito, se han determinado más de 130.000 estructuras cristalinas de rayos X de proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas. El método competitivo más cercano en el número de estructuras analizadas es la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) , que ha resuelto menos de una décima parte. La cristalografía puede resolver estructuras de moléculas arbitrariamente grandes, mientras que la RMN en estado de solución se restringe a las relativamente pequeñas (menos de 70 k Da ). La cristalografía de rayos X se utiliza de forma rutinaria para determinar cómo un fármaco interactúa con su objetivo proteico y qué cambios podrían mejorarlo. Sin embargo, las proteínas de membrana intrínsecas siguen siendo difíciles de cristalizar porque requieren detergentes u otros desnaturalizantes para solubilizarlas de forma aislada, y tales detergentes a menudo interfieren con la cristalización. Las proteínas de membrana son un gran componente del genoma e incluyen muchas proteínas de gran importancia fisiológica, como los canales iónicos y los receptores . Los criogénicos con helio se utilizan para prevenir el daño por radiación en los cristales de proteínas.

En el otro extremo de la escala de tamaño, incluso las moléculas relativamente pequeñas pueden plantear desafíos para el poder de resolución de la cristalografía de rayos X. La estructura asignada en 1991 al antibiótico aislado de un organismo marino, diazonamida A (C 40 H 34 Cl 2 N 6 O 6 , masa molar 765,65 g / mol), resultó ser incorrecta por la prueba clásica de estructura: una muestra sintética no era idéntico al producto natural. El error se atribuyó a la incapacidad de la cristalografía de rayos X para distinguir entre los grupos -OH / -NH correctos y los grupos -NH 2 / -O- intercambiados en la estructura incorrecta. Sin embargo, con los avances en la instrumentación, se pueden distinguir grupos similares utilizando difractómetros modernos de rayos X monocristalinos.

A pesar de ser una herramienta invaluable en biología estructural , la cristalografía de proteínas conlleva algunos problemas inherentes a su metodología que dificultan la interpretación de los datos. La red cristalina, que se forma durante el proceso de cristalización, contiene numerosas unidades de la proteína purificada, que están empaquetadas densa y simétricamente en el cristal. Al buscar una proteína previamente desconocida, descubrir su forma y límites dentro de la red cristalina puede ser un desafío. Las proteínas generalmente se componen de subunidades más pequeñas, y la tarea de distinguir entre las subunidades e identificar la proteína real puede ser un desafío incluso para los cristalógrafos experimentados. Las interfaces no biológicas que ocurren durante la cristalización se conocen como contactos de empaquetamiento de cristales (o simplemente, contactos de cristales) y no se pueden distinguir por medios cristalográficos. Cuando una nueva estructura de proteína se resuelve mediante cristalografía de rayos X y se deposita en el Protein Data Bank , se solicita a sus autores que especifiquen el "ensamblaje biológico" que constituiría la proteína funcional y biológicamente relevante. Sin embargo, los errores, los datos faltantes y las anotaciones inexactas durante el envío de los datos dan lugar a estructuras oscuras y comprometen la fiabilidad de la base de datos. Se ha informado que la tasa de error en el caso de anotaciones defectuosas solo es superior al 6,6% o aproximadamente al 15%, posiblemente un tamaño no trivial considerando el número de estructuras depositadas. Este "problema de clasificación de interfaces" se aborda típicamente mediante enfoques computacionales y se ha convertido en un tema reconocido en bioinformática estructural .

Técnicas de dispersión

Dispersión elástica frente a inelástica

La cristalografía de rayos X es una forma de dispersión elástica ; los rayos X salientes tienen la misma energía y, por lo tanto, la misma longitud de onda que los rayos X entrantes, solo que con una dirección alterada. Por el contrario, la dispersión inelástica se produce cuando la energía se transfiere desde los rayos X entrantes al cristal, por ejemplo, al excitar un electrón de la capa interna a un nivel de energía más alto . Tal dispersión inelástica reduce la energía (o aumenta la longitud de onda) del haz saliente. La dispersión inelástica es útil para sondear tales excitaciones de la materia, pero no para determinar la distribución de los dispersores dentro de la materia, que es el objetivo de la cristalografía de rayos X.

Los rayos X varían en longitud de onda de 10 a 0,01 nanómetros ; una longitud de onda típica utilizada para la cristalografía es 1  Å (0,1 nm), que está en la escala de enlaces químicos covalentes y el radio de un solo átomo. Los fotones de longitud de onda más larga (como la radiación ultravioleta ) no tendrían suficiente resolución para determinar las posiciones atómicas. En el otro extremo, los fotones de longitud de onda más corta, como los rayos gamma, son difíciles de producir en grandes cantidades, difíciles de enfocar e interactúan con demasiada fuerza con la materia, produciendo pares partícula-antipartícula . Por lo tanto, los rayos X son el "punto dulce" de la longitud de onda al determinar las estructuras de resolución atómica a partir de la dispersión de la radiación electromagnética .

Otras técnicas de rayos X

Otras formas de dispersión elástica de rayos X además de la difracción monocristalina incluyen la difracción de polvo , la dispersión de rayos X de ángulo pequeño ( SAXS ) y varios tipos de difracción de fibra de rayos X , que fue utilizada por Rosalind Franklin para determinar la estructura de doble hélice. de ADN . En general, la difracción de rayos X de cristal único ofrece más información estructural que estas otras técnicas; sin embargo, requiere un cristal lo suficientemente grande y regular, que no siempre está disponible.

Estos métodos de dispersión generalmente utilizan rayos X monocromáticos , que están restringidos a una sola longitud de onda con desviaciones menores. También se puede utilizar un amplio espectro de rayos X (es decir, una combinación de rayos X con diferentes longitudes de onda) para llevar a cabo la difracción de rayos X, una técnica conocida como método de Laue. Este es el método utilizado en el descubrimiento original de la difracción de rayos X. La dispersión de Laue proporciona mucha información estructural con solo una breve exposición al haz de rayos X y, por lo tanto, se utiliza en estudios estructurales de eventos muy rápidos ( cristalografía resuelta en el tiempo ). Sin embargo, no es tan adecuado como la dispersión monocromática para determinar la estructura atómica completa de un cristal y, por lo tanto, funciona mejor con cristales con arreglos atómicos relativamente simples.

El modo de reflexión posterior de Laue registra los rayos X dispersos hacia atrás desde una fuente de amplio espectro. Esto es útil si la muestra es demasiado espesa para que los rayos X la transmitan. Los planos de difracción en el cristal se determinan sabiendo que la normal al plano de difracción biseca el ángulo entre el haz incidente y el haz difractado. Se puede utilizar un gráfico de Greninger para interpretar la fotografía de Laue de reflexión posterior.

Difracción de electrones y neutrones

Se pueden usar otras partículas, como electrones y neutrones , para producir un patrón de difracción . Aunque la dispersión de electrones, neutrones y rayos X se basa en diferentes procesos físicos, los patrones de difracción resultantes se analizan utilizando las mismas técnicas de imágenes de difracción coherente .

Como se deduce a continuación, la densidad de electrones dentro del cristal y los patrones de difracción se relacionan mediante un método matemático simple, la transformada de Fourier , que permite calcular la densidad con relativa facilidad a partir de los patrones. Sin embargo, esto solo funciona si la dispersión es débil , es decir, si los haces dispersos son mucho menos intensos que el haz entrante. Los rayos débilmente dispersos atraviesan el resto del cristal sin sufrir un segundo evento de dispersión. Estas ondas redispersadas se denominan "dispersión secundaria" y dificultan el análisis. Cualquier cristal lo suficientemente grueso producirá una dispersión secundaria, pero dado que los rayos X interactúan relativamente débilmente con los electrones, esto generalmente no es una preocupación importante. Por el contrario, los haces de electrones pueden producir una fuerte dispersión secundaria incluso para cristales relativamente delgados (> 100 nm). Dado que este grosor corresponde al diámetro de muchos virus , una dirección prometedora es la difracción de electrones de conjuntos macromoleculares aislados , como cápsides virales y máquinas moleculares , que se puede realizar con un microscopio crioelectrónico . Además, la fuerte interacción de los electrones con la materia (aproximadamente 1000 veces más fuerte que para los rayos X) permite determinar la estructura atómica de volúmenes extremadamente pequeños. El campo de aplicaciones de la cristalografía electrónica abarca desde biomoléculas como proteínas de membrana sobre películas delgadas orgánicas hasta estructuras complejas de compuestos intermetálicos (nanocristalinos) y zeolitas.

La difracción de neutrones es un método excelente para la determinación de estructuras, aunque ha sido difícil obtener haces de neutrones monocromáticos intensos en cantidades suficientes. Tradicionalmente se han utilizado reactores nucleares , aunque cada vez se dispone más de fuentes que producen neutrones por espalación . Al estar descargados, los neutrones se dispersan mucho más fácilmente desde los núcleos atómicos que desde los electrones. Por lo tanto, la dispersión de neutrones es muy útil para observar las posiciones de los átomos de luz con pocos electrones, especialmente el hidrógeno , que es esencialmente invisible en la difracción de rayos X. La dispersión de neutrones también tiene la propiedad notable de que el solvente puede hacerse invisible ajustando la proporción de agua normal , H 2 O y agua pesada , D 2 O.

Métodos

Descripción general de la difracción de rayos X de monocristal

Flujo de trabajo para resolver la estructura de una molécula mediante cristalografía de rayos X.

El método más antiguo y preciso de cristalografía de rayos X es la difracción de rayos X de cristal único , en la que un haz de rayos X incide en un cristal único y produce haces dispersos. Cuando aterrizan en un trozo de película u otro detector, estos haces crean un patrón de difracción de puntos; la fuerza y ​​los ángulos de estos rayos se registran a medida que el cristal gira gradualmente. Cada punto se denomina reflejo , ya que corresponde al reflejo de los rayos X de un conjunto de planos espaciados uniformemente dentro del cristal. Para monocristales de suficiente pureza y regularidad, los datos de difracción de rayos X pueden determinar las longitudes y ángulos medios de los enlaces químicos dentro de unas pocas milésimas de angstrom y unas pocas décimas de grado , respectivamente. Los átomos de un cristal no son estáticos, sino que oscilan alrededor de sus posiciones medias, por lo general en menos de unas pocas décimas de angstrom. La cristalografía de rayos X permite medir el tamaño de estas oscilaciones.

Procedimiento

La técnica de la cristalografía de rayos X de monocristal tiene tres pasos básicos. El primer paso, y a menudo el más difícil, es obtener un cristal adecuado del material en estudio. El cristal debe ser lo suficientemente grande (normalmente mayor de 0,1 mm en todas las dimensiones), de composición pura y estructura regular, sin imperfecciones internas significativas como grietas o macla .

En el segundo paso, el cristal se coloca en un intenso haz de rayos X, generalmente de una sola longitud de onda ( rayos X monocromáticos ), produciendo el patrón regular de reflejos. Se miden los ángulos e intensidades de los rayos X difractados, teniendo cada compuesto un patrón de difracción único. A medida que el cristal gira gradualmente, los reflejos anteriores desaparecen y aparecen otros nuevos; la intensidad de cada punto se registra en cada orientación del cristal. Es posible que deban recopilarse varios conjuntos de datos, cada uno de los cuales cubre un poco más de la mitad de una rotación completa del cristal y, por lo general, contiene decenas de miles de reflejos.

En el tercer paso, estos datos se combinan computacionalmente con información química complementaria para producir y refinar un modelo de la disposición de los átomos dentro del cristal. El modelo final y refinado de la disposición atómica, ahora llamado estructura cristalina, generalmente se almacena en una base de datos pública.

Limitaciones

A medida que la unidad de repetición del cristal, su celda unitaria, se vuelve más grande y más compleja, la imagen de nivel atómico proporcionada por la cristalografía de rayos X se vuelve menos bien resuelta (más "borrosa") para un número dado de reflejos observados. A menudo se identifican dos casos limitantes de cristalografía de rayos X: la cristalografía de "molécula pequeña" (que incluye sólidos inorgánicos continuos) y la cristalografía "macromolecular". La cristalografía de moléculas pequeñas típicamente involucra cristales con menos de 100 átomos en su unidad asimétrica ; tales estructuras cristalinas suelen estar tan bien resueltas que los átomos pueden discernirse como "manchas" aisladas de densidad electrónica. Por el contrario, la cristalografía macromolecular a menudo involucra a decenas de miles de átomos en la celda unitaria. Tales estructuras cristalinas están generalmente menos bien resueltas (más "manchadas"); los átomos y los enlaces químicos aparecen como tubos de densidad electrónica, más que como átomos aislados. En general, las moléculas pequeñas también son más fáciles de cristalizar que las macromoléculas; sin embargo, la cristalografía de rayos X ha demostrado ser posible incluso para virus y proteínas con cientos de miles de átomos, gracias a la mejora de la tecnología e imágenes cristalográficas. Aunque normalmente la cristalografía de rayos X solo se puede realizar si la muestra está en forma de cristal, se han realizado nuevas investigaciones para muestrear formas no cristalinas de muestras.

Cristalización

Un cristal de proteína visto al microscopio . Los cristales que se utilizan en la cristalografía de rayos X pueden tener un diámetro inferior a un milímetro.

Aunque la cristalografía puede usarse para caracterizar el desorden en un cristal impuro o irregular, la cristalografía generalmente requiere un cristal puro de alta regularidad para resolver la estructura de una complicada disposición de átomos. A veces se pueden obtener cristales puros y regulares a partir de materiales naturales o sintéticos, como muestras de metales , minerales u otros materiales macroscópicos. La regularidad de tales cristales a veces se puede mejorar con el recocido de cristales macromoleculares y otros métodos. Sin embargo, en muchos casos, obtener un cristal con calidad de difracción es la principal barrera para resolver su estructura de resolución atómica.

La cristalografía de moléculas pequeñas y macromolecular difieren en la gama de posibles técnicas utilizadas para producir cristales con calidad de difracción. Las moléculas pequeñas generalmente tienen pocos grados de libertad conformacional y pueden cristalizarse mediante una amplia gama de métodos, como la deposición química en fase vapor y la recristalización . Por el contrario, las macromoléculas tienen generalmente muchos grados de libertad y su cristalización debe realizarse para mantener una estructura estable. Por ejemplo, las proteínas y las moléculas de ARN más grandes no se pueden cristalizar si su estructura terciaria se ha desplegado ; por lo tanto, el rango de condiciones de cristalización está restringido a condiciones de solución en las que tales moléculas permanecen plegadas.

Tres métodos de preparación de cristales, A: Gota colgante. B: Gota sentada. C: microdiálisis

Los cristales de proteína casi siempre se cultivan en solución. El enfoque más común es reducir la solubilidad de las moléculas que lo componen de manera muy gradual; si se hace demasiado rápido, las moléculas se precipitarán de la solución, formando un polvo inútil o un gel amorfo en el fondo del recipiente. El crecimiento de cristales en solución se caracteriza por dos pasos: nucleación de un cristalito microscópico (posiblemente con solo 100 moléculas), seguido del crecimiento de ese cristalito, idealmente a un cristal con calidad de difracción. Las condiciones de solución que favorecen el primer paso (nucleación) no son siempre las mismas condiciones que favorecen el segundo paso (crecimiento posterior). El objetivo del cristalógrafo es identificar las condiciones de la solución que favorezcan el desarrollo de un solo cristal grande, ya que los cristales más grandes ofrecen una resolución mejorada de la molécula. En consecuencia, las condiciones de la solución deberían desfavorecer el primer paso (nucleación) pero favorecer el segundo (crecimiento), de modo que solo se forme un cristal grande por gota. Si se favorece demasiado la nucleación, se formará una lluvia de pequeños cristalitos en la gota, en lugar de un gran cristal; si se favorece muy poco, no se formará cristal alguno. Otros enfoques implican la cristalización de proteínas bajo aceite, donde las soluciones acuosas de proteínas se dispensan bajo aceite líquido y el agua se evapora a través de la capa de aceite. Los diferentes aceites tienen diferentes permeabilidades a la evaporación, por lo que producen cambios en las tasas de concentración de diferentes mezclas de percipientes / proteínas.

Es extremadamente difícil predecir buenas condiciones para la nucleación o el crecimiento de cristales bien ordenados. En la práctica, las condiciones favorables se identifican mediante cribado ; se prepara un lote muy grande de moléculas y se prueba una amplia variedad de soluciones de cristalización. Por lo general, se prueban cientos, incluso miles, de condiciones de solución antes de encontrar la correcta. Las diversas condiciones pueden utilizar uno o más mecanismos físicos para reducir la solubilidad de la molécula; por ejemplo, algunos pueden cambiar el pH, algunos contienen sales de la serie Hofmeister o productos químicos que reducen la constante dieléctrica de la solución, y otros contienen polímeros grandes como el polietilenglicol que sacan la molécula de la solución por efectos entrópicos. También es común probar varias temperaturas para estimular la cristalización, o bajar gradualmente la temperatura para que la solución se vuelva sobresaturada. Estos métodos requieren grandes cantidades de la molécula diana, ya que utilizan una alta concentración de la (s) molécula (s) a cristalizar. Debido a la dificultad para obtener cantidades tan grandes ( miligramos ) de proteína de grado de cristalización, se han desarrollado robots que son capaces de dispensar con precisión gotas de prueba de cristalización del orden de 100 nanolitros en volumen. Esto significa que se usa 10 veces menos proteína por experimento en comparación con los ensayos de cristalización realizados a mano (del orden de 1 microlitro ).

Se sabe que varios factores inhiben o estropean la cristalización. Los cristales en crecimiento generalmente se mantienen a una temperatura constante y protegidos de golpes o vibraciones que puedan perturbar su cristalización. Las impurezas en las moléculas o en las soluciones de cristalización son a menudo adversas a la cristalización. La flexibilidad conformacional en la molécula también tiende a hacer que la cristalización sea menos probable, debido a la entropía. Las moléculas que tienden a autoensamblarse en hélices regulares a menudo no están dispuestas a ensamblarse en cristales. Los cristales se pueden estropear por el hermanamiento , que puede ocurrir cuando una celda unitaria puede empaquetarse igualmente favorablemente en múltiples orientaciones; aunque los avances recientes en los métodos computacionales pueden permitir resolver la estructura de algunos cristales maclados. Si no ha podido cristalizar una molécula diana, un cristalógrafo puede volver a intentarlo con una versión ligeramente modificada de la molécula; incluso pequeños cambios en las propiedades moleculares pueden dar lugar a grandes diferencias en el comportamiento de cristalización.

Recopilación de datos

Montaje del cristal

Animación que muestra los cinco movimientos posibles con un goniómetro kappa de cuatro círculos. Las rotaciones alrededor de cada uno de los cuatro ángulos φ, κ, ω y 2θ dejan el cristal dentro del haz de rayos X, pero cambian la orientación del cristal. El detector (cuadro rojo) se puede deslizar más cerca o más lejos del cristal, lo que permite tomar datos de mayor resolución (si están más cerca) o un mejor discernimiento de los picos de Bragg (si están más lejos).

El cristal se monta para las mediciones de modo que se pueda sostener en el haz de rayos X y girar. Hay varios métodos de montaje. En el pasado, los cristales se cargaban en capilares de vidrio con la solución de cristalización (el licor madre ). Hoy en día, los cristales de moléculas pequeñas se adhieren típicamente con aceite o pegamento a una fibra de vidrio o un lazo, que está hecho de nailon o plástico y se adhiere a una varilla sólida. Los cristales de proteína se recogen mediante un asa y luego se congelan rápidamente con nitrógeno líquido . Esta congelación reduce el daño por radiación de los rayos X, así como el ruido en los picos de Bragg debido al movimiento térmico (el efecto Debye-Waller). Sin embargo, los cristales de proteína no tratados a menudo se agrietan si se congelan instantáneamente; por lo tanto, generalmente se sumergen previamente en una solución crioprotectora antes de congelarlos. Desafortunadamente, este remojo previo puede hacer que el cristal se agriete, arruinándolo para la cristalografía. Generalmente, las criocondiciones exitosas se identifican mediante prueba y error.

El capilar o bucle está montado en un goniómetro , lo que permite colocarlo con precisión dentro del haz de rayos X y rotarlo. Dado que tanto el cristal como el haz son a menudo muy pequeños, el cristal debe estar centrado dentro del haz con una precisión de ~ 25 micrómetros, con la ayuda de una cámara enfocada en el cristal. El tipo más común de goniómetro es el "goniómetro kappa", que ofrece tres ángulos de rotación: el ángulo ω, que gira alrededor de un eje perpendicular al haz; el ángulo κ, alrededor de un eje a ~ 50 ° con respecto al eje ω; y, finalmente, el ángulo φ sobre el eje del bucle / capilar. Cuando el ángulo κ es cero, los ejes ω y φ están alineados. La rotación κ permite un montaje conveniente del cristal, ya que el brazo en el que está montado el cristal se puede girar hacia el cristalógrafo. Las oscilaciones que se llevan a cabo durante la recopilación de datos (que se mencionan a continuación) afectan únicamente al eje ω. Un tipo más antiguo de goniómetro es el goniómetro de cuatro círculos y sus parientes, como el goniómetro de seis círculos.

Fuentes de rayos X

Ánodo giratorio

La cristalografía a pequeña escala se puede realizar con una fuente de tubo de rayos X local , normalmente junto con un detector de placa de imagen . Estos tienen la ventaja de ser relativamente económicos y fáciles de mantener, y permiten una rápida selección y recolección de muestras. Sin embargo, la longitud de onda de la luz producida está limitada por la disponibilidad de diferentes materiales de ánodos . Además, la intensidad está limitada por la potencia aplicada y la capacidad de enfriamiento disponible para evitar la fusión del ánodo. En tales sistemas, los electrones se evaporan de un cátodo y se aceleran a través de un fuerte potencial eléctrico de ~ 50  kV ; habiendo alcanzado una alta velocidad, los electrones chocan con una placa de metal, emitiendo bremsstrahlung y algunas líneas espectrales fuertes correspondientes a la excitación de los electrones de la capa interna del metal. El metal más utilizado es el cobre , que se puede mantener frío fácilmente debido a su alta conductividad térmica y que produce fuertes líneas K α y K β . En ocasiones, la línea K β se suprime con una fina lámina de níquel (~ 10 µm). La variedad más simple y barata de tubo de rayos X sellado tiene un ánodo estacionario (el tubo de Crookes ) y funciona con ~ 2  kW de potencia de haz de electrones. La variedad más cara tiene una fuente de tipo ánodo giratorio que funciona con ~ 14 kW de potencia de rayo electrónico.

Los rayos X generalmente se filtran (mediante el uso de filtros de rayos X ) a una sola longitud de onda (se hacen monocromáticos) y se coliman en una sola dirección antes de que se les permita golpear el cristal. El filtrado no solo simplifica el análisis de los datos, sino que también elimina la radiación que degrada el cristal sin aportar información útil. La colimación se realiza con un colimador (básicamente, un tubo largo) o con una inteligente disposición de espejos suavemente curvados. Se prefieren los sistemas de espejos para cristales pequeños (menos de 0,3 mm) o con celdas unitarias grandes (más de 150 Å).

Joanna (Joka) Maria Vandenberg utilizó ánodos giratorios en los primeros experimentos que demostraron el poder de los rayos X para la detección rápida (en tiempo real) de grandes obleas de película delgada de InGaAsP para el control de calidad de láseres de pozos cuánticos .

Tubo de microfoco

Un desarrollo más reciente es el tubo de microenfoque , que puede entregar un flujo de haz al menos tan alto (después de la colimación) como las fuentes de ánodo giratorio, pero solo requiere una potencia de haz de unas pocas decenas o cientos de vatios en lugar de varios kilovatios.

Radiación de sincrotrón

Las fuentes de radiación de sincrotrón son algunas de las fuentes de luz más brillantes de la tierra y son algunas de las herramientas más poderosas disponibles para los cristalógrafos de rayos X. Haces de rayos X generados en grandes máquinas llamadas sincrotrones que aceleran partículas cargadas eléctricamente, a menudo electrones, hasta casi la velocidad de la luz y las confinan en un bucle (aproximadamente) circular utilizando campos magnéticos.

Los sincrotrones son generalmente instalaciones nacionales, cada una con varias líneas de luz dedicadas donde los datos se recopilan sin interrupción. Los sincrotrones fueron diseñados originalmente para ser utilizados por físicos de alta energía que estudian partículas subatómicas y fenómenos cósmicos . El componente más grande de cada sincrotrón es su anillo de almacenamiento de electrones. Este anillo en realidad no es un círculo perfecto, sino un polígono de muchos lados. En cada esquina del polígono o sector, los imanes alineados con precisión doblan la corriente de electrones. A medida que se dobla el camino de los electrones, emiten ráfagas de energía en forma de rayos X.

El uso de radiación de sincrotrón con frecuencia tiene requisitos específicos para la cristalografía de rayos X. La intensa radiación ionizante puede provocar daños por radiación en las muestras, especialmente en los cristales macromoleculares. La criocristalografía protege la muestra del daño por radiación al congelar el cristal a temperaturas de nitrógeno líquido (~ 100 K ). Sin embargo, la radiación de sincrotrón con frecuencia tiene la ventaja de longitudes de onda seleccionables por el usuario, lo que permite experimentos de dispersión anómala que maximizan la señal anómala. Esto es fundamental en experimentos como la dispersión anómala de longitud de onda única (SAD) y la dispersión anómala de longitud de onda múltiple (MAD).

Láser de electrones libres

Los láseres de electrones libres se han desarrollado para su uso en cristalografía de rayos X. Estas son las fuentes de rayos X más brillantes disponibles actualmente; con los rayos X llegando en ráfagas de femtosegundos . La intensidad de la fuente es tal que los patrones de difracción de resolución atómica pueden resolverse para cristales que de otro modo serían demasiado pequeños para la recolección. Sin embargo, la fuente de luz intensa también destruye la muestra, lo que requiere disparar múltiples cristales. Como cada cristal está orientado aleatoriamente en el haz, se deben recopilar cientos de miles de imágenes de difracción individuales para obtener un conjunto de datos completo. Este método, la cristalografía de femtosegundos en serie , se ha utilizado para resolver la estructura de una serie de estructuras cristalinas de proteínas, notando a veces diferencias con estructuras equivalentes recogidas de fuentes de sincrotrón.

Grabando los reflejos

Un patrón de difracción de rayos X de una enzima cristalizada. El patrón de manchas ( reflejos ) y la fuerza relativa de cada mancha ( intensidades ) se pueden utilizar para determinar la estructura de la enzima.

Cuando un cristal se monta y se expone a un haz intenso de rayos X, los dispersa en un patrón de puntos o reflejos que se pueden observar en una pantalla detrás del cristal. Se puede ver un patrón similar al enfocar un puntero láser en un disco compacto . Las intensidades relativas de estos puntos proporcionan la información para determinar la disposición de las moléculas dentro del cristal en detalle atómico. Las intensidades de estas reflexiones se pueden registrar con una película fotográfica , un detector de área (como un detector de píxeles ) o con un sensor de imagen de dispositivo de carga acoplada (CCD). Los picos en ángulos pequeños corresponden a datos de baja resolución, mientras que aquellos en ángulos altos representan datos de alta resolución; por tanto, se puede determinar un límite superior en la resolución final de la estructura a partir de las primeras imágenes. En este punto se pueden determinar algunas medidas de la calidad de la difracción, como la mosaicidad del cristal y su desorden general, como se observa en los anchos de los picos. En este punto también se pueden diagnosticar rápidamente algunas patologías del cristal que lo harían inadecuado para resolver la estructura.

Una imagen de manchas es insuficiente para reconstruir todo el cristal; representa solo una pequeña porción de la transformada de Fourier completa. Para recopilar toda la información necesaria, el cristal debe rotarse paso a paso 180 °, con una imagen registrada en cada paso; en realidad, se requiere un poco más de 180 ° para cubrir el espacio recíproco , debido a la curvatura de la esfera de Ewald . Sin embargo, si el cristal tiene una simetría más alta, se puede registrar un rango angular más pequeño, como 90 ° o 45 °. El eje de rotación debe cambiarse al menos una vez, para evitar desarrollar un "punto ciego" en el espacio recíproco cerca del eje de rotación. Es habitual oscilar el cristal ligeramente (entre 0,5 y 2 °) para captar una región más amplia del espacio recíproco.

Es posible que se necesiten varios conjuntos de datos para determinados métodos de escalonamiento . Por ejemplo, la fase de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda requiere que la dispersión se registre al menos tres (y normalmente cuatro, por redundancia) longitudes de onda de la radiación de rayos X entrante. Un solo cristal puede degradarse demasiado durante la recopilación de un conjunto de datos, debido al daño por radiación; en tales casos, se deben tomar conjuntos de datos sobre múltiples cristales.

Análisis de los datos

Simetría de cristal, celda unitaria y escala de imagen

La serie registrada de patrones de difracción bidimensionales, cada uno correspondiente a una orientación de cristal diferente, se convierte en un modelo tridimensional de la densidad electrónica; la conversión utiliza la técnica matemática de las transformadas de Fourier, que se explica a continuación . Cada punto corresponde a un tipo diferente de variación en la densidad de electrones; el cristalógrafo debe determinar qué variación corresponde a qué punto ( indexación ), las fuerzas relativas de los puntos en diferentes imágenes ( fusión y escalado ) y cómo deben combinarse las variaciones para obtener la densidad total de electrones ( fase ).

El procesamiento de datos comienza con la indexación de las reflexiones. Esto significa identificar las dimensiones de la celda unitaria y qué pico de imagen corresponde a qué posición en el espacio recíproco. Un subproducto de la indexación es determinar la simetría del cristal, es decir, su grupo espacial . Algunos grupos espaciales se pueden eliminar desde el principio. Por ejemplo, no se pueden observar simetrías de reflexión en moléculas quirales; por lo tanto, solo se permiten 65 grupos espaciales de 230 posibles para moléculas de proteína que casi siempre son quirales. La indexación se logra generalmente usando una rutina de autoindexación . Una vez asignada la simetría, los datos se integran . Esto convierte los cientos de imágenes que contienen los miles de reflejos en un solo archivo, que consta de (como mínimo) registros del índice de Miller de cada reflejo y una intensidad para cada reflejo (en este estado, el archivo a menudo también incluye estimaciones de error y medidas de parcialidad (qué parte de una determinada reflexión se registró en esa imagen)).

Un conjunto de datos completo puede consistir en cientos de imágenes separadas tomadas en diferentes orientaciones del cristal. El primer paso es fusionar y escalar estas diversas imágenes, es decir, identificar qué picos aparecen en dos o más imágenes ( fusionando ) y escalar las imágenes relativas para que tengan una escala de intensidad constante. La optimización de la escala de intensidad es fundamental porque la intensidad relativa de los picos es la información clave a partir de la cual se determina la estructura. La técnica repetitiva de recopilación de datos cristalográficos y la simetría a menudo alta de los materiales cristalinos hacen que el difractómetro registre muchas reflexiones equivalentes a la simetría varias veces. Esto permite calcular el factor R relacionado con la simetría , un índice de confiabilidad basado en cuán similares son las intensidades medidas de las reflexiones equivalentes a la simetría, evaluando así la calidad de los datos.

Fase inicial

Los datos recopilados de un experimento de difracción son una representación espacial recíproca de la red cristalina. La posición de cada "punto" de difracción se rige por el tamaño y la forma de la celda unitaria y la simetría inherente dentro del cristal. Se registra la intensidad de cada "punto" de difracción, y esta intensidad es proporcional al cuadrado de la amplitud del factor de estructura . El factor de estructura es un número complejo que contiene información relacionada tanto con la amplitud como con la fase de una onda . Para obtener un mapa de densidad de electrones interpretable , se deben conocer tanto la amplitud como la fase (un mapa de densidad de electrones permite que un cristalógrafo construya un modelo inicial de la molécula). La fase no se puede registrar directamente durante un experimento de difracción: esto se conoce como problema de fase . Las estimaciones de la fase inicial se pueden obtener de diversas formas:

  • Métodos directos o defase ab initio  : este suele ser el método de elección para moléculas pequeñas (<1000 átomos distintos de hidrógeno) y se ha utilizado con éxito para resolver los problemas de fase de proteínas pequeñas. Si la resolución de los datos es mejor que 1,4 Å (140 pm),se pueden utilizarmétodos directospara obtener información de fase, aprovechando las relaciones de fase conocidas entre ciertos grupos de reflexiones.
  • Reemplazo molecular  : si se conoce una estructura relacionada, se puede utilizar como modelo de búsqueda en el reemplazo molecular para determinar la orientación y posición de las moléculas dentro de la celda unitaria. Las fases obtenidas de esta manera se pueden utilizar para generar mapas de densidad de electrones.
  • Dispersión anómala de rayos X ( fase MAD o SAD ): la longitud de onda de los rayos X se puede escanear más allá de un borde de absorción de un átomo, lo que cambia la dispersión de una manera conocida. Al registrar conjuntos completos de reflexiones en tres longitudes de onda diferentes (muy por debajo, muy por encima y en el medio del borde de absorción), se puede resolver la subestructura de los átomos que difractan anómalamente y, por lo tanto, la estructura de la molécula completa. El método más popular de incorporar átomos de dispersión anómalos en proteínas es expresar la proteína en unauxótrofo de metionina (un huésped incapaz de sintetizar metionina) en un medio rico en selenometionina, que contieneátomos de selenio . Luego, se puede realizar un experimento de dispersión anómala de longitud de onda múltiple (MAD) alrededor del borde de absorción, que luego debería producir la posición de cualquier residuo de metionina dentro de la proteína, proporcionando fases iniciales.
  • Métodos de átomos pesados ( sustitución isomorfa múltiple ): si se pueden introducir átomos metálicos densos en electrones en el cristal, se pueden utilizar métodos directos o métodos del espacio de Patterson para determinar su ubicación y obtener las fases iniciales. Dichos átomos pesados ​​pueden introducirse empapando el cristal en una solución que contenga un átomo pesado o por cocristalización (haciendo crecer los cristales en presencia de un átomo pesado). Al igual que en la fase de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda, los cambios en las amplitudes de dispersión se pueden interpretar para producir las fases. Aunque este es el método original mediante el cual se resolvieron las estructuras cristalinas de proteínas, ha sido reemplazado en gran medida por la fase de dispersión anómala de múltiples longitudes de onda con selenometionina.

Construcción de modelos y refinamiento de fases

Estructura de una hélice alfa de proteína, con figuras de palo para el enlace covalente dentro de la densidad de electrones para la estructura cristalina a resolución ultra alta (0,91 Å). Los contornos de densidad están en gris, la columna vertebral de la hélice en blanco, las cadenas laterales en cian, los átomos de O en rojo, los átomos de N en azul y los enlaces de hidrógeno como líneas de puntos verdes.
Representación 3D de la densidad electrónica (azul) de un ligando (naranja) unido a un sitio de unión en una proteína (amarillo). La densidad de electrones se obtiene a partir de datos experimentales y el ligando se modela en esta densidad de electrones.

Habiendo obtenido las fases iniciales, se puede construir un modelo inicial. Las posiciones atómicas en el modelo y sus respectivos factores de Debye-Waller (o factores B , que representan el movimiento térmico del átomo) se pueden refinar para ajustarse a los datos de difracción observados, lo que idealmente produce un mejor conjunto de fases. A continuación, se puede ajustar un nuevo modelo al nuevo mapa de densidad de electrones y se llevan a cabo sucesivas rondas de refinamiento. Este proceso interactivo continúa hasta que se maximiza la correlación entre los datos de difracción y el modelo. El acuerdo se mide mediante un factor R definido como

donde F es el factor de estructura . Un criterio de calidad similar es R libre , que se calcula a partir de un subconjunto (~ 10%) de reflejos que no se incluyeron en el refinamiento de la estructura. Ambos factores R dependen de la resolución de los datos. Como regla general, R libre debe ser aproximadamente la resolución en angstroms dividida por 10; por lo tanto, un conjunto de datos con una resolución de 2 Å debería producir un R libre final de ~ 0,2. Las características de los enlaces químicos como la estereoquímica, los enlaces de hidrógeno y la distribución de las longitudes y ángulos de los enlaces son medidas complementarias de la calidad del modelo. El sesgo de fase es un problema grave en este tipo de construcción de modelos iterativos. Omitir mapas es una técnica común que se usa para verificar esto.

Puede que no sea posible observar todos los átomos de la unidad asimétrica. En muchos casos, el desorden cristalográfico mancha el mapa de densidad electrónica. Los átomos que se dispersan débilmente, como el hidrógeno, son habitualmente invisibles. También es posible que un solo átomo aparezca varias veces en un mapa de densidad de electrones, por ejemplo, si una cadena lateral de proteína tiene múltiples (<4) conformaciones permitidas. En otros casos más, el cristalógrafo puede detectar que la estructura covalente deducida de la molécula era incorrecta o cambiaba. Por ejemplo, las proteínas pueden escindirse o sufrir modificaciones postraduccionales que no se detectaron antes de la cristalización.

Trastorno

Un desafío común en el refinamiento de las estructuras cristalinas resulta del desorden cristalográfico. El trastorno puede adoptar muchas formas, pero en general implica la coexistencia de dos o más especies o conformaciones. No reconocer el desorden da como resultado una interpretación errónea. Las trampas del modelado incorrecto del desorden se ilustran con la hipótesis descontada del isomería del estiramiento del enlace . El trastorno se modela con respecto a la población relativa de los componentes, a menudo solo dos, y su identidad. En estructuras de grandes moléculas e iones, el solvente y los contraiones a menudo están desordenados.

Análisis de datos computacionales aplicados

El uso de métodos computacionales para el análisis de datos de difracción de rayos X en polvo está ahora generalizado. Por lo general, compara los datos experimentales con el difractograma simulado de la estructura de un modelo, teniendo en cuenta los parámetros instrumentales, y refina los parámetros estructurales o microestructurales del modelo utilizando un algoritmo de minimización basado en mínimos cuadrados . La mayoría de las herramientas disponibles que permiten la identificación de fases y el refinamiento estructural se basan en el método Rietveld , siendo algunas de ellas software abierto y gratuito como FullProf Suite, Jana2006, MAUD, Rietan, GSAS, etc., mientras que otras están disponibles bajo licencias comerciales como Diffrac. Suite TOPAS, Match !, etc. La mayoría de estas herramientas también permiten el refinamiento de Le Bail (también conocido como coincidencia de perfiles), es decir, el refinamiento de los parámetros de la celda basados ​​en las posiciones de los picos de Bragg y los perfiles de los picos, sin tener en cuenta la cristalográfica estructura por sí misma. Las herramientas más recientes permiten el refinamiento de datos tanto estructurales como microestructurales, como el programa FAULTS incluido en FullProf Suite, que permite el refinamiento de estructuras con defectos planos (por ejemplo, fallas de apilamiento, hermanamientos, intercrecimientos).

Deposición de la estructura

Una vez que se ha finalizado el modelo de la estructura de una molécula, a menudo se deposita en una base de datos cristalográfica como Cambridge Structural Database (para moléculas pequeñas), Inorganic Crystal Structure Database (ICSD) (para compuestos inorgánicos) o Protein Data Bank ( para proteínas y, a veces, ácidos nucleicos). Muchas estructuras obtenidas en empresas comerciales privadas para cristalizar proteínas de importancia medicinal no están depositadas en bases de datos cristalográficas públicas.

Teoría de la difracción

El objetivo principal de la cristalografía de rayos X es determinar la densidad de electrones f ( r ) en todo el cristal, donde r representa el vector de posición tridimensional dentro del cristal. Para ello, se utiliza la dispersión de rayos X para recopilar datos sobre su transformada de Fourier F ( q ), que se invierte matemáticamente para obtener la densidad definida en el espacio real, utilizando la fórmula

donde la integral se toma sobre todos los valores de q . El vector real tridimensional q representa un punto en el espacio recíproco , es decir, a una oscilación particular en la densidad de electrones cuando uno se mueve en la dirección en la que apunta q . La longitud de q corresponde a dividida por la longitud de onda de la oscilación. La fórmula correspondiente para una transformada de Fourier se utilizará a continuación

donde la integral se suma a todos los valores posibles del vector de posición r dentro del cristal.

La transformada de Fourier F ( q ) es generalmente un número complejo y, por lo tanto, tiene una magnitud | F ( q ) | y una fase φ ( q ) relacionada por la ecuación

Las intensidades de las reflexiones observadas en la difracción de rayos X nos dan las magnitudes | F ( q ) | pero no las fases φ ( q ). Para obtener las fases, se recolectan conjuntos completos de reflejos con alteraciones conocidas de la dispersión, ya sea modulando la longitud de onda más allá de un cierto borde de absorción o agregando átomos metálicos fuertemente dispersantes (es decir, densos en electrones) como el mercurio . La combinación de magnitudes y fases produce la transformada de Fourier completa F ( q ), que puede invertirse para obtener la densidad electrónica f ( r ).

Los cristales a menudo se idealizan como perfectamente periódicos. En ese caso ideal, los átomos se colocan en una red perfecta, la densidad de electrones es perfectamente periódica y la transformada de Fourier F ( q ) es cero, excepto cuando q pertenece a la red recíproca (los llamados picos de Bragg ). En realidad, sin embargo, los cristales no son perfectamente periódicos; los átomos vibran alrededor de su posición media, y puede haber desórdenes de varios tipos, como mosaicos , dislocaciones , varios defectos puntuales y heterogeneidad en la conformación de moléculas cristalizadas. Por lo tanto, los picos de Bragg tienen un ancho finito y puede haber una dispersión difusa significativa , un continuo de rayos X dispersos que caen entre los picos de Bragg.

Comprensión intuitiva según la ley de Bragg

Se puede obtener una comprensión intuitiva de la difracción de rayos X a partir del modelo de difracción de Bragg . En este modelo, una reflexión determinada se asocia con un conjunto de láminas espaciadas uniformemente que atraviesan el cristal, por lo general pasan por los centros de los átomos de la red cristalina. La orientación de un conjunto particular de hojas se identifica mediante sus tres índices de Miller ( h , k , l ), y su espaciado se indica mediante d . William Lawrence Bragg propuso un modelo en el que los rayos X entrantes se dispersan de forma especular (como un espejo) de cada plano; a partir de esa suposición, los rayos X dispersos desde planos adyacentes se combinarán de manera constructiva ( interferencia constructiva ) cuando el ángulo θ entre el plano y el rayo X dé como resultado una diferencia de longitud de trayectoria que sea un múltiplo entero n de la longitud de onda del rayo X λ .

Se dice que una reflexión está indexada cuando sus índices de Miller (o, más correctamente, sus componentes de vector reticular recíprocos ) se han identificado a partir de la longitud de onda conocida y el ángulo de dispersión 2θ. Tal indexación da los parámetros de la celda unitaria , las longitudes y ángulos de la celda unitaria, así como su grupo espacial . Sin embargo, dado que la ley de Bragg no interpreta las intensidades relativas de las reflexiones, generalmente es inadecuado resolver la disposición de los átomos dentro de la celda unitaria; para eso, se debe realizar un método de transformada de Fourier.

Dispersión como transformada de Fourier

El haz de rayos X entrante tiene una polarización y debe representarse como una onda vectorial; sin embargo, por simplicidad, déjelo que se represente aquí como una onda escalar. También ignoramos la complicación de la dependencia temporal de la onda y solo nos concentramos en la dependencia espacial de la onda. Las ondas planas se pueden representar mediante un vector de onda k in , por lo que la fuerza de la onda entrante en el tiempo t  = 0 viene dada por

En la posición r dentro de la muestra, sea una densidad de dispersores f ( r ); Estos dispersores deben producir una onda esférica dispersa de amplitud proporcional a la amplitud local de la onda entrante multiplicada por el número de dispersores en un volumen pequeño dV alrededor de r

donde S es la constante de proporcionalidad.

Considere la fracción de ondas dispersas que salen con un vector de onda saliente de k out y golpean la pantalla en r pantalla . Como no se pierde energía (dispersión elástica, no inelástica), las longitudes de onda son las mismas que las magnitudes de los vectores de onda | k en | = | k fuera |. Desde el momento en que el fotón se dispersa en r hasta que se absorbe en la pantalla r , el fotón sufre un cambio de fase.

La radiación neta que llega a la pantalla r es la suma de todas las ondas dispersas por todo el cristal.

que puede escribirse como una transformada de Fourier

donde q = k fuera  - k adentro . La intensidad medida de la reflexión será el cuadrado de esta amplitud.

Compañeros de Friedel y Bijvoet

Por cada reflexión correspondiente a un punto q en el espacio recíproco, hay otra reflexión de la misma intensidad en el punto opuesto - q . Este reflejo opuesto se conoce como el compañero de Friedel del reflejo original. Esta simetría resulta del hecho matemático de que la densidad de electrones f ( r ) en una posición r es siempre un número real . Como se señaló anteriormente, f ( r ) es la transformada inversa de su transformada de Fourier F ( q ); sin embargo, dicha transformada inversa es un número complejo en general. Para asegurar que f ( r ) es real, la transformada de Fourier F ( q ) debe ser tal que las parejas de Friedel F (- q ) y F ( q ) sean conjugados complejos entre sí. Por lo tanto, F (- q ) tiene la misma magnitud que F ( q ) pero tienen la fase opuesta, es decir, φ ( q ) = - φ ( q )

La igualdad de sus magnitudes asegura que los mates de Friedel tengan la misma intensidad | F | 2 . Esta simetría permite medir la transformada de Fourier completa desde solo la mitad del espacio recíproco, por ejemplo, girando el cristal un poco más de 180 ° en lugar de una revolución completa de 360 ​​°. En cristales con simetría significativa, incluso más reflejos pueden tener la misma intensidad (mate Bijvoet); en tales casos, puede ser necesario medir incluso menos del espacio recíproco. En casos favorables de alta simetría, a veces solo se requieren 90 ° o incluso solo 45 ° de datos para explorar completamente el espacio recíproco.

La restricción de Friedel-mate se puede derivar de la definición de la transformada de Fourier inversa

Dado que la fórmula de Euler establece que e i x = cos ( x ) + i sin ( x ), la transformada de Fourier inversa se puede separar en una suma de una parte puramente real y una parte puramente imaginaria

La función f ( r ) es real si y solo si la segunda integral I sen es cero para todos los valores de r . A su vez, esto es cierto si y solo si se satisface la restricción anterior

puesto que el pecado = - I pecado implica que me pecado  = 0.

Esfera de Ewald

Cada imagen de difracción de rayos X representa solo un corte, un corte esférico de espacio recíproco, como puede verse en la construcción de la esfera de Ewald. Tanto k out como k in tienen la misma longitud, debido a la dispersión elástica, ya que la longitud de onda no ha cambiado. Por lo tanto, pueden representarse como dos vectores radiales en una esfera en el espacio recíproco , que muestra los valores de q que se muestrean en una imagen de difracción dada. Dado que existe una ligera dispersión en las longitudes de onda entrantes del haz de rayos X entrante, los valores de | F ( q ) | se puede medir solo para q vectores ubicados entre las dos esferas correspondientes a esos radios. Por lo tanto, para obtener un conjunto completo de datos de la transformada de Fourier, es necesario rotar el cristal un poco más de 180 °, o algunas veces menos si existe suficiente simetría. No se necesita una rotación completa de 360 ​​° debido a una simetría intrínseca a las transformadas de Fourier de funciones reales (como la densidad de electrones), pero se necesita "un poco más" de 180 ° para cubrir todo el espacio recíproco dentro de una resolución dada debido a la curvatura de la esfera de Ewald . En la práctica, el cristal se balancea una pequeña cantidad (0,25–1 °) para incorporar reflejos cerca de los límites de las conchas esféricas de Ewald.

Función de Patterson

Un resultado bien conocido de las transformadas de Fourier es el teorema de autocorrelación , que establece que la autocorrelación c ( r ) de una función f ( r )

tiene una transformada de Fourier C ( q ) que es la magnitud al cuadrado de F ( q )

Por lo tanto, la función de autocorrelación c ( r ) de la densidad de electrones (también conocida como función de Patterson ) se puede calcular directamente a partir de las intensidades de reflexión, sin calcular las fases. En principio, esto podría usarse para determinar directamente la estructura cristalina; sin embargo, es difícil de realizar en la práctica. La función de autocorrelación corresponde a la distribución de vectores entre átomos en el cristal; por tanto, un cristal de átomos de N en su celda unitaria puede tener  picos de N ( N - 1) en su función de Patterson. Dados los errores inevitables en la medición de las intensidades y las dificultades matemáticas de reconstruir las posiciones atómicas a partir de los vectores interatómicos, esta técnica rara vez se usa para resolver estructuras, excepto para los cristales más simples.

Ventajas de un cristal

En principio, se podría determinar una estructura atómica aplicando dispersión de rayos X a muestras no cristalinas, incluso a una sola molécula. Sin embargo, los cristales ofrecen una señal mucho más fuerte debido a su periodicidad. Una muestra cristalina es periódica por definición; un cristal se compone de muchas celdas unitarias repetidas indefinidamente en tres direcciones independientes. Estos sistemas periódicos tienen una transformada de Fourier que se concentra en puntos que se repiten periódicamente en el espacio recíproco conocido como picos de Bragg ; los picos de Bragg corresponden a los puntos de reflexión observados en la imagen de difracción. Dado que la amplitud de estas reflexiones crece linealmente con el número N de dispersores, la intensidad observada de estos puntos debería crecer de forma cuadrática, como N 2 . En otras palabras, el uso de un cristal concentra la dispersión débil de las celdas unitarias individuales en una reflexión mucho más potente y coherente que se puede observar por encima del ruido. Este es un ejemplo de interferencia constructiva .

En una muestra líquida, en polvo o amorfa, las moléculas dentro de esa muestra tienen orientaciones aleatorias. Tales muestras tienen un espectro de Fourier continuo que distribuye uniformemente su amplitud reduciendo así la intensidad de la señal medida, como se observa en SAXS . Más importante aún, se pierde la información de orientación. Aunque teóricamente posible, es experimentalmente difícil obtener estructuras de resolución atómica de moléculas asimétricas complicadas a partir de estos datos promediados rotacionalmente. Un caso intermedio es la difracción de fibra en la que las subunidades se disponen periódicamente en al menos una dimensión.

Premios Nobel de cristalografía de rayos X

Año Laureado Premio Razón fundamental
1914 Max von Laue Física "Por su descubrimiento de la difracción de los rayos X por cristales", un paso importante en el desarrollo de la espectroscopia de rayos X .
1915 William Henry Bragg Física "Por sus servicios en el análisis de estructura cristalina mediante rayos X"
William Lawrence Bragg
1962 Max F. Perutz Química "por sus estudios de las estructuras de las proteínas globulares "
John C. Kendrew
1962 James Dewey Watson Medicamento "Por sus descubrimientos sobre la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su importancia para la transferencia de información en material vivo"
Francis Harry Compton Crick
Maurice Hugh Frederick Wilkins
1964 Dorothy Hodgkin Química "Por sus determinaciones mediante técnicas de rayos X de las estructuras de importantes sustancias bioquímicas"
1972 Stanford Moore Química "Por su contribución a la comprensión de la conexión entre la estructura química y la actividad catalítica del centro activo de la molécula de ribonucleasa "
William H. Stein
1976 William N. Lipscomb Química "Por sus estudios sobre la estructura de los boranos iluminando problemas de enlaces químicos"
1985 Jerome Karle Química "Por sus destacados logros en el desarrollo de métodos directos para la determinación de estructuras cristalinas"
Herbert A. Hauptman
1988 Johann Deisenhofer Química "Para su determinación de la estructura tridimensional de un centro de reacción fotosintética "
Hartmut Michel Química
Robert Huber Química
1997 John E. Walker Química "Por su elucidación del mecanismo enzimático subyacente a la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP)"
2003 Roderick MacKinnon Química "Por descubrimientos sobre canales en membranas celulares [...] para estudios estructurales y mecanicistas de canales iónicos "
Peter Agre "Por descubrimientos sobre canales en las membranas celulares [...] para el descubrimiento de canales de agua "
2006 Roger D. Kornberg Química "Por sus estudios de las bases moleculares de la transcripción eucariota "
2009 Ada E. Yonath Química "Para estudios de la estructura y función del ribosoma "
Thomas A. Steitz
Venkatraman Ramakrishnan
2012 Brian Kobilka Química "Para estudios de receptores acoplados a proteína G "

Aplicaciones

La difracción de rayos X tiene amplias y diversas aplicaciones en las ciencias químicas, bioquímicas, físicas, de materiales y mineralógicas. Laue afirmó en 1937 que la técnica "ha extendido el poder de observar estructuras diminutas diez mil veces más allá de lo que nos da el microscopio". La difracción de rayos X es análoga a un microscopio con resolución de nivel atómico que muestra los átomos y su distribución de electrones.

La difracción de rayos X, la difracción de electrones y la difracción de neutrones brindan información sobre la estructura de la materia, cristalina y no cristalina, a nivel atómico y molecular. Además, estos métodos pueden aplicarse en el estudio de las propiedades de todos los materiales, inorgánicos, orgánicos o biológicos. Debido a la importancia y variedad de aplicaciones de los estudios de difracción de cristales, se han otorgado muchos premios Nobel por tales estudios.

Identificación de drogas

La difracción de rayos X se ha utilizado para la identificación de antibióticos como: ocho β-lactámicos ( ampicilina sódica , penicilina G procaína , cefalexina , ampicilina trihidrato, penicilina benzatínica , bencilpenicilina sódica , cefotaxima sódica , ceftriaxona sódica ), tres tetraciclina ( doxiciclina clorhidrato , oxitetraciclina deshidratada , clorhidrato de tetraciclina ) y dos antibióticos macrólidos ( azitromicina , estolato de eritromicina ). Cada uno de estos medicamentos tiene un patrón de Difracción de Rayos X (XRD) único que hace posible su identificación.

Caracterización de nanomateriales, fibras textiles y polímeros

El examen forense de cualquier rastro de evidencia se basa en el principio de intercambio de Locard . Este establece que "cada contacto deja un rastro". En la práctica, aunque se haya producido una transferencia de material, puede ser imposible de detectar, porque la cantidad transferida es muy pequeña.

XRD ha demostrado su papel en el avance de la investigación de nanomateriales. Es una de las principales herramientas de caracterización y proporciona información sobre las propiedades estructurales de varios nanomateriales tanto en forma de polvo como de película fina.

Las fibras textiles son una mezcla de sustancias cristalinas y amorfas. Por tanto, la medida del grado de cristalinidad aporta datos útiles en la caracterización de fibras mediante difractometría de rayos X. Se ha informado que se utilizó difracción de rayos X para identificar un depósito "cristalino" que se encontró en una silla. Se encontró que el depósito era amorfo, pero el patrón de difracción presente coincidía con el del polimetilmetacrilato. La espectrometría de masas de pirólisis identificó posteriormente el depósito como parámetros de cristal de polimetilcianoacrilato de Boin.

Investigación de huesos

El calentamiento o la quema de huesos provoca cambios reconocibles en el mineral óseo que pueden detectarse mediante técnicas de XRD. Durante los primeros 15 minutos de calentamiento a 500 ° C o más, los cristales óseos comenzaron a cambiar. A temperaturas más altas, el grosor y la forma de los cristales de los huesos parecen estabilizados, pero cuando las muestras se calentaron a una temperatura más baja o durante un período más corto, las trazas XRD mostraron cambios extremos en los parámetros de los cristales.

Circuitos integrados

Se ha demostrado que la difracción de rayos X es un método para investigar la compleja estructura de los circuitos integrados .

Ver también

Referencias

Otras lecturas

Tablas internacionales de cristalografía

  • Theo Hahn, ed. (2002). Tablas internacionales de cristalografía. Volumen A, Simetría de grupos espaciales (5ª ed.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers , para la Unión Internacional de Cristalografía . ISBN 0-7923-6590-9.
  • Michael G. Rossmann; Eddy Arnold, eds. (2001). Tablas internacionales de cristalografía. Volumen F, Cristalografía de moléculas biológicas . Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, para la Unión Internacional de Cristalografía. ISBN 0-7923-6857-6.
  • Theo Hahn, ed. (1996). Tablas internacionales de cristalografía. Breve edición didáctica del Volumen A, Simetría de grupos espaciales (4ª ed.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, para la Unión Internacional de Cristalografía. ISBN 0-7923-4252-6.

Colecciones encuadernadas de artículos

Libros de texto

Análisis de datos computacionales aplicados

  • Young, RA, ed. (1993). El método Rietveld . Oxford: Oxford University Press y Unión Internacional de Cristalografía. ISBN 0-19-855577-6.

Histórico

  • Bijvoet JM ; Burgers WG; Hägg G; eds. (1969). Primeros artículos sobre la difracción de rayos X por cristales . Yo . Utrecht: publicado para la Unión Internacional de Cristalografía por Uitgeversmaatschappij NV de A. OosthoekCS1 maint: texto adicional: lista de autores ( enlace )
  • Bijvoet JM; Burgers WG; Hägg G, eds. (1972). Primeros artículos sobre la difracción de rayos X por cristales . II . Utrecht: publicado para la Unión Internacional de Cristalografía por Uitgeversmaatschappij NV de A. Oosthoek
  • Bragg WL; Phillips DC y Lipson H (1992). El desarrollo del análisis de rayos X . Nueva York: Dover. ISBN 0-486-67316-2.
  • Ewald, PP ; y numerosos cristalógrafos, eds. (1962). Cincuenta años de difracción de rayos X . Utrecht: publicado para la Unión Internacional de Cristalografía por Uitgeversmaatschappij NV doi de A. Oosthoek : 10.1007 / 978-1-4615-9961-6 . ISBN 978-1-4615-9963-0.
  • Ewald, PP, editor 50 Years of X-Ray Diffraction (Reimpreso en formato pdf para el XVIII Congreso de la UICr, Glasgow, Escocia, Unión Internacional de Cristalografía).
  • Friedrich W. (1922). "Die Geschichte der Auffindung der Röntgenstrahlinterferenzen" . Die Naturwissenschaften . 10 (16): 363. Bibcode : 1922NW ..... 10..363F . doi : 10.1007 / BF01565289 . S2CID  28141506 .
  • Lonsdale, K (1949). Cristales y radiografías . Nueva York: D. van Nostrand.
  • "Las estructuras de la vida". Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. 2007. Cite journal requiere |journal=( ayuda )

enlaces externos

Tutoriales

Bases de datos primarias

Bases de datos derivadas

Validación estructural