Ensayo de tetramero - Tetramer assay

Un ensayo de tetrámero (también conocido como tinción de tetrámero ) es un procedimiento que usa proteínas tetraméricas para detectar y cuantificar las células T que son específicas para un antígeno dado dentro de una muestra de sangre. Los tetrámeros utilizados en el ensayo están formados por cuatro moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), que se encuentran en la superficie de la mayoría de las células del cuerpo. Las moléculas de MHC presentan péptidos a las células T como una forma de comunicar la presencia de virus, bacterias, mutaciones cancerosas u otros antígenos en una célula. Si el receptor de una célula T coincide con el péptido que presenta una molécula de MHC, se desencadena una respuesta inmune. Por lo tanto, los tetrámeros de MHC que se diseñan mediante bioingeniería para presentar un péptido específico pueden usarse para encontrar células T con receptores que coincidan con ese péptido.

Los tetrámeros se marcan con un fluoróforo , lo que permite analizar las células T unidas al tetrámero con citometría de flujo . La cuantificación y clasificación de las células T mediante citometría de flujo permite a los investigadores investigar la respuesta inmune a la infección viral y la administración de vacunas, así como la funcionalidad de las células T específicas de antígeno. Generalmente, si el sistema inmunológico de una persona ha encontrado un patógeno , el individuo poseerá células T con especificidad hacia algún péptido de ese patógeno. Por lo tanto, si una tinción de tetrámero específico para un péptido patógeno da como resultado una señal positiva, esto puede indicar que el sistema inmunológico de la persona ha encontrado y construido una respuesta a ese patógeno.

Historia

Esta metodología fue publicada por primera vez en 1996 por un laboratorio de la Universidad de Stanford. Los intentos anteriores de cuantificar las células T específicas de antígeno involucraron el ensayo de dilución limitante menos preciso, que estima el número de células T en 50-500 veces por debajo de sus niveles reales. Las tinciones que utilizan monómeros de MHC solubles tampoco tuvieron éxito debido a la baja afinidad de unión de los receptores de células T y los monómeros de péptidos de MHC. Los tetrámeros de MHC pueden unirse a más de un receptor en la célula T diana, lo que da como resultado una fuerza de unión total aumentada y tasas de disociación más bajas.

Usos

Células T CD8 +

Las tinciones con tetramer generalmente analizan poblaciones de linfocitos T citotóxicos (CTL). Los CTL también se denominan células T CD8 + porque tienen correceptores CD8 que se unen a moléculas del MHC de clase I. La mayoría de las células del cuerpo expresan moléculas del MHC de clase I, que son responsables de procesar los antígenos intracelulares y de presentarse en la superficie celular. Si los péptidos que presentan las moléculas del MHC de clase I son extraños, por ejemplo, derivados de proteínas virales en lugar de las propias proteínas de la célula, el CTL con un receptor que coincide con el péptido destruirá la célula. Las tinciones con tetramer permiten la visualización, cuantificación y clasificación de estas células mediante citometría de flujo, que es extremadamente útil en inmunología . Las poblaciones de células T se pueden rastrear durante la duración de un virus o después de la aplicación de una vacuna. Las tinciones de tetramero también se pueden combinar con ensayos funcionales como ELIspot, que detecta la cantidad de células secretoras de citocinas en una muestra.

Construcción MHC Clase I Tetramer

Un tetrámero de MHC que se une a los receptores de células T (izquierda) y una molécula de MHC en la superficie de una célula presentadora de antígenos que se une a los receptores de células T (derecha)

Las moléculas de tetrámero de MHC desarrolladas en un laboratorio pueden imitar el complejo presentador de antígeno en las células y unirse a las células T que reconocen el antígeno. Las moléculas del MHC de clase I están formadas por una cadena α pesada polimórfica asociada con una microglobulina beta-2 de cadena ligera invariante (β2m). Escherichia coli se utiliza para sintetizar la cadena ligera y una versión abreviada de la cadena pesada que incluye la etiqueta de reconocimiento de biotina de 15 aminoácidos. Estas cadenas de MHC se biotinilan con la enzima BirA y se replegan con el péptido antigénico de interés. La biotina es una molécula pequeña que forma un fuerte vínculo con otra proteína llamada estreptavidina. Se añade estreptavidina marcada con fluoróforo a los monómeros de MHC de bioingeniería, y la interacción biotina-estreptavidina hace que cuatro monómeros de MHC se unan a la estreptavidina y creen un tetrámero. Cuando los tetrámeros se mezclan con una muestra de sangre, se unirán a las células T que expresan el receptor específico de antígeno apropiado. Cualquier tetrámero de MHC que no esté unido se elimina por lavado de la muestra antes de analizarla con citometría de flujo.

Los avances recientes dentro de las moléculas MHC recombinantes han democratizado la formulación del complejo peptídico MHC y la posterior multimerización. Las formulaciones altamente activas de una amplia gama de moléculas MHC de clase I ahora permiten a los usuarios no expertos crear sus propios complejos péptido-MHC personalizados día a día en cualquier laboratorio sin equipo especial.

Células T CD4 +

También se han desarrollado tetrameros que se unen a las células T auxiliares. Las células T colaboradoras o las células T CD4 + expresan correceptores CD4 . Se unen a moléculas del MHC de clase II , que solo se expresan en células presentadoras de antígenos profesionales como las células dendríticas o los macrófagos . Las moléculas del MHC de clase II presentan antígenos extracelulares, lo que permite que las células T auxiliares detecten bacterias, hongos y parásitos. El uso de tetrámeros de MHC de clase II se está volviendo más común, pero los tetrámeros son más difíciles de crear que los tetrámeros de clase I y el vínculo entre las células T auxiliares y las moléculas de MHC es aún más débil.

Células T asesinas naturales

Las células T asesinas naturales ( células NKT) también se pueden visualizar con tecnología tetrámero. Las células NKT se unen a proteínas que presentan antígenos lipídicos o glicolípidos . El complejo presentador de antígeno al que se unen las células NKT involucra proteínas CD1 , por lo que los tetrámeros hechos de CD1 se pueden usar para teñir las células NKT.

Ejemplos de

Una aplicación temprana de la tecnología de tetrámeros se centró en la respuesta inmune mediada por células a la infección por VIH . Los tetrámeros de MHC se desarrollaron para presentar antígenos del VIH y se usaron para encontrar el porcentaje de CTL específicos para esos antígenos del VIH en muestras de sangre de pacientes infectados. Esto se comparó con los resultados de los ensayos citotóxicos y la carga viral de ARN plasmático para caracterizar la función de los CTL en la infección por VIH. Los CTL que se unieron a los tetrámeros se clasificaron en pocillos ELIspot para el análisis de la secreción de citocinas.

Otro estudio utilizó complejos de tetrámeros de MHC para investigar la efectividad de un método de administración de vacunas contra la influenza . A los ratones se les administraron vacunas subcutáneas e intranasales para la influenza y se usaron tinciones de tetrámero junto con citometría de flujo para cuantificar los CTL específicos del antígeno usado en la vacuna. Esto permitió comparar la respuesta inmune (el número de células T que atacan a un virus) en dos métodos diferentes de administración de vacunas.

Referencias

Otras lecturas