Escurrimiento nuclear - Nuclear run-on
Se realiza un ensayo de ejecución nuclear para identificar los genes que se están transcribiendo en un momento determinado. Aproximadamente un millón de núcleos de células se aíslan y se incuban con nucleótidos marcados , y los genes en proceso de transcripción se detectan mediante hibridación del ARN extraído con sondas específicas de genes en una transferencia . García-Martínez y col. (2004) desarrollaron un protocolo para la levadura S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO) que permite el cálculo de las tasas de transcripción (TR) de todos los genes de levadura para estimar las estabilidades de ARNm para todos los ARNm de levadura.
Recientemente se han desarrollado métodos alternativos de microarrays, principalmente PolII RIP-chip: inmunoprecipitación de ARN de la ARN polimerasa II con anticuerpos dirigidos al dominio C-terminal fosforilado e hibridación en un portaobjetos o chip de microarrays (la palabra chip en el nombre proviene de "ChIP-chip" donde se requería un GeneChip Affymetrix especial ). Se ha realizado una comparación de métodos basados en run-on y ChIP-chip en levadura (Pelechano et al., 2009). Se ha detectado una correspondencia general de ambos métodos, pero GRO es más sensible y cuantitativo. Debe tenerse en cuenta que el run-on solo detecta elongación de las ARN polimerasas, mientras que el chip ChIP detecta todas las ARN polimerasas presentes, incluidas las retrotraídas.
La unión de nueva ARN polimerasa a genes se evita mediante la inclusión de sarkosyl . Por lo tanto, solo los genes que ya tienen una ARN polimerasa producirán transcripciones marcadas. Las transcripciones de ARN que se sintetizaron antes de la adición de la etiqueta no se detectarán, ya que carecerán de la etiqueta. Estos que se ejecutan en transcripciones también se pueden detectar purificando las transcripciones marcadas mediante el uso de anticuerpos que detectan la marca e hibridando estas transcripciones aisladas con matrices de expresión génica o mediante secuenciación de próxima generación (GRO-Seq).
Los ensayos de ejecución se han sustituido en gran medida por los ensayos de ejecución global que utilizan la secuenciación de ADN de próxima generación como plataforma de lectura. Estos ensayos se conocen como GRO-Seq y proporcionan una vista increíblemente detallada de los genes que participan en la transcripción con niveles cuantitativos de expresión. Los métodos basados en matrices para analizar ensayos de ejecución global (GRO) se están reemplazando por la secuenciación de próxima generación, que elimina el diseño de sondas contra secuencias de genes. La secuenciación catalogará todas las transcripciones producidas incluso si no se informan en las bases de datos. GRO-seq implica el etiquetado de transcripciones recién sintetizadas con bromouridina (BrU). Las células o los núcleos se incuban con BrUTP en presencia de sarkosyl , que evita la unión de la ARN polimerasa al ADN. Por lo tanto, solo la ARN polimerasa que ya se encuentra en el ADN antes de la adición de sarkosyl producirá nuevas transcripciones que se marcarán con BrU. Los transcritos marcados se capturan con perlas marcadas con anticuerpos anti-BrU, se convierten en ADNc y luego se secuencian mediante secuenciación de ADN de próxima generación. Las lecturas de secuenciación se alinean luego con el genoma y el número de lecturas por transcripción proporciona una estimación precisa del número de transcripciones sintetizadas.