Fosfolipasa D específica de N-acil fosfatidiletanolamina - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

La N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipasa D ( NAPE-PLD ) es una enzima que cataliza la liberación de N-aciletanolamina (NAE) a partir de N-acil-fosfatidiletanolamina (NAPE). Esta es una parte importante del proceso que convierte los lípidos ordinarios en señales químicas como anandamida y oleoiletanolamina . En los seres humanos, la proteína NAPE-PLD está codificada por el gen NAPEPLD .

Descubrimiento

NAPE-PLD es una actividad enzimática , una fosfolipasa , que actúa sobre los fosfolípidos que se encuentran en la membrana celular . No es homología pero el resultado de su actividad química que las clases como la fosfolipasa D . La actividad enzimática se descubrió y caracterizó en una serie de experimentos que culminaron en la publicación de 2004 de un esquema de purificación bioquímica a partir del cual se pudo lograr la secuenciación de péptidos . Los investigadores homogeneizaron (finamente molidos) corazones de 150 ratas y sometieron el lisado crudo resultante a una sedimentación de sacarosa a 105.000 xg para separar las membranas celulares del resto de la célula. Las proteínas integrales de la membrana se solubilizaron usando octilglucósido y se sometieron a cuatro etapas de cromatografía en columna (columna de intercambio catiónico HiTrap SP HP, columna de intercambio aniónico HiTrap Q, columna de afinidad HiTrap Blue, columna de hidroxiapatita Bio-Gel HTP). Cada uno de estos separa los diferentes tipos de proteínas de membrana en diferentes recipientes de muestra cuando las proteínas se eluyen de la columna a lo largo del tiempo, y midiendo la actividad de las muestras en cada recipiente fue posible rastrear cuáles recibieron la enzima activa. La medición de la actividad enzimática se realizó mediante cromatografía en capa fina de un sustrato radiactivo sensible a la actividad enzimática NAPE-PLD: Escisión del sustrato afectado donde apareció en la placa cuando se detectó la radiación en un analizador de bioimagen.

El resultado de este extenso procedimiento todavía no era una proteína pura, pero produjo un número limitado de bandas por SDS-PAGE , y se encontró que una banda de 46 kilodaltons se correlacionaba en intensidad con la actividad enzimática. Esta banda se cortó del gel y se digirió con tripsina , y los péptidos de la misma se separaron entre sí mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa . A continuación, los fragmentos resultantes se microsecuenciaron mediante una degradación de Edman automatizada . Tres correspondían a vimentina , una proteína de filamento intermedio de 56 kDa que se cree que es un contaminante, y los otros dos coincidían con el clon de ADNc identificado posteriormente como NAPE-PLD.

Una vez obtenida esta pista, la identificación pudo ser confirmada por un procedimiento menos oneroso: la sobreexpresión del supuesto ADNc de NAPE-PLD en células COS-7 produjo una fuerte actividad enzimática de NAPE-PLD, cuyas características demostraron ser similares a las de el extracto de corazón original.

Caracteristicas

La secuencia de ADNc de NAPEPLD predice 396 secuencias de aminoácidos tanto en ratones como en ratas, que son 89% y 90% idénticas a las de los seres humanos. Se encontró que NAPE-PLD no tiene homología con los genes conocidos de fosfolipasa D , pero puede clasificarse por homología para caer en la familia de metalohidrolasas de zinc del pliegue de beta-lactamasa . En particular, se observó el motivo altamente conservado H X ( E / H ) X D ( C / R / S / H ) X _50-70 H X _15-30 ( C / S / D ) X _30-70 H , que se asocia, en general, con la unión de zinc y la reacción de hidrólisis en esta clase de proteínas, lo que lleva a los autores a proponer que la actividad debería estar correlacionada con el contenido de zinc.

Cuando recombinante NAPE-PLD se ensayó en células COS in vitro que tenía una actividad similar hacia varios radiomarcados sustratos: N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine, y N-stearoylphosphatidylethanolamine todo hace reaccionar con un K _m entre 2-4 micromolar y una V _máx. Entre 73 y 101 nanomoles por miligramo por minuto, calculado por el gráfico de Lineweaver-Burk . (Estos generan N- palmitoiletanolamina , anandamida , N- oleoiletanolamina , y N-stearoylethanolamine, respectivamente) La enzima también reaccionó N-palmitoil-liso-fosfatidiletanolamina y N-araquidonoil-liso-fosfatidiletanolamina con K similares _m pero en un tercio a la -cuarta la V _máx . Estas actividades concuerdan con la observación de que muchos tejidos producen una variedad de N- aciletanolaminas .

Sin embargo, NAPE-PLD no tenía capacidad para producir ácido fosfatídico detectable a partir de fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina como lo catalizan otras enzimas fosfolipasa D. También carece de la actividad de transfosfatidilación de la fosfolipasa D que permite la creación de alcoholes fosfatidílicos en lugar de ácido fosfatídico en presencia de etanol o butanol .

Ruta

Esta enzima actúa como el segundo paso de una ruta bioquímica iniciada por la creación de N-acilfosfatidiletanolamina , mediante la transferencia de un grupo acilo desde la posición sn -1 del glicerofosfolípido al grupo amino de la fosfatidiletanolamina . Si bien NAPE-PLD contribuye a la biosíntesis de varias NAE en el sistema nervioso central de los mamíferos , no está claro si esta enzima no es responsable de la formación del endocannabinoide anandamida , ya que se ha informado que los ratones knockout para NAPE-PLD tienen niveles o niveles muy reducidos de anandamida.

Las N-aciletanolaminas liberadas por esta enzima se convierten en sustratos potenciales para la amida hidrolasa de ácido graso (FAAH), que hidroliza los ácidos grasos libres de la etanolamina . Los defectos en esta enzima pueden hacer que los productos NAPE-PLD, como la anandamida, se acumulen a niveles 15 veces más altos de lo que normalmente se observa.

Estructura

Esta enzima de membrana forma homodímeros , parcialmente separados por un canal interno de ∼9-Å de ancho. El pliegue de la proteína metalo beta-lactamasa está adaptado para asociarse con fosfolípidos de membrana . Una cavidad hidrófoba proporciona una vía de entrada para el sustrato NAPE en el sitio activo, donde un centro de zinc binuclear cataliza su hidrólisis. Los ácidos biliares se unen con alta afinidad a las bolsas selectivas en esta cavidad, mejorando el ensamblaje del dímero y permitiendo la catálisis. NAPE-PLD facilita la diafonía entre las señales de los ácidos biliares y las señales de las amidas de lípidos.

Referencias