Luciferasa - Luciferase

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Familia de monooxigenasa de luciferasa bacteriana
Identificadores
Símbolo Bac_luciferasa
Pfam PF00296
InterPro IPR016048
PROSITE PDOC00397
SCOP2 1nfp / SCOPe / SUPFAM
Dominio catalítico de dinoflagelados luciferasa
PDB 1vpr EBI.jpg
estructura cristalina de un dominio de luciferasa del dinoflagelado Lingulodinium polyedrum
Identificadores
Símbolo Luciferase_cat
Pfam PF10285
InterPro IPR018804
Dominio N-terminal de dinoflagelados luciferasa / LBP
Identificadores
Símbolo Luciferase_N
Pfam PF05295
InterPro IPR007959
Dominio de haz helicoidal de dinoflagelados luciferasa
Identificadores
Símbolo Luciferase_3H
Pfam PF10284
InterPro IPR018475

La luciferasa es un término genérico para la clase de enzimas oxidativas que producen bioluminiscencia y generalmente se distingue de una fotoproteína . El nombre fue utilizado por primera vez por Raphaël Dubois, quien inventó las palabras luciferina y luciferasa, para el sustrato y la enzima , respectivamente. Ambas palabras se derivan de la palabra latina lucifer , que significa portador de luz .

Luciferasa de luciérnaga
Luciérnaga luciferasa Crystal Structure.rsh.png
Estructura de la luciferasa de luciérnaga Photinus pyralis .
Identificadores
Organismo Photinus pyralis
Símbolo Luciferasa de luciérnaga
PDB 1LCI Más estructuras
UniProt P08659
Otros datos
Número CE 1.13.12.7

Las luciferasas se utilizan ampliamente en biotecnología , para microscopía y como genes indicadores , para muchas de las mismas aplicaciones que las proteínas fluorescentes . Sin embargo, a diferencia de las proteínas fluorescentes, las luciferasas no requieren una fuente de luz externa , pero sí requieren la adición de luciferina , el sustrato consumible.

Ejemplos de

Una variedad de organismos regulan su producción de luz usando diferentes luciferasas en una variedad de reacciones emisoras de luz. La mayoría de las luciferasas estudiadas se han encontrado en animales, incluidas las luciérnagas y muchos animales marinos como los copépodos , las medusas y el pensamiento marino . Sin embargo, las luciferasas se han estudiado en hongos luminosos, como el hongo Jack-O-Lantern , así como ejemplos en otros reinos, incluidas las bacterias luminosas y los dinoflagelados .

Luciérnaga y haga clic en escarabajo

Las luciferasas de las luciérnagas , de las cuales hay más de 2000 especies , y de las otras Elateroidea (escarabajos clic y parientes en general) son lo suficientemente diversas como para ser útiles en la filogenia molecular . En las luciérnagas, el oxígeno requerido se suministra a través de un tubo en el abdomen llamado tráquea abdominal . Una luciferasa bien estudiada es la de la luciérnaga Photinini Photinus pyralis , que tiene un pH óptimo de 7,8.

Pensamiento de mar

También está muy estudiado el pensamiento de mar , Renilla reniformis . En este organismo, la luciferasa ( Renilla-luciferina 2-monooxigenasa ) está estrechamente asociada con una proteína de unión a luciferina, así como con una proteína verde fluorescente ( GFP ). El calcio desencadena la liberación de luciferina ( coelenterazina ) de la proteína de unión a luciferina. Entonces, el sustrato está disponible para la oxidación por la luciferasa, donde se degrada a coelenteramida con una liberación de energía resultante. En ausencia de GFP, esta energía se liberaría como un fotón de luz azul (longitud de onda de emisión máxima de 482 nm). Sin embargo, debido a la GFP estrechamente asociada, la energía liberada por la luciferasa se acopla a través de la transferencia de energía de resonancia al fluoróforo de la GFP y, posteriormente, se libera como un fotón de luz verde (longitud de onda de emisión máxima de 510 nm). La reacción catalizada es:

Copépodo

Recientemente se han identificado luciferasas más nuevas que, a diferencia de otras luciferasas, son moléculas secretadas naturalmente. Un ejemplo de este tipo es la luciferasa dependiente de coelenterazina de Metridia (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) que se deriva del copépodo marino Metridia longa . El gen de luciferasa secretado por Metridia longa codifica una proteína de 24 kDa que contiene un péptido señal secretora N-terminal de 17 residuos de aminoácidos . La sensibilidad y la alta intensidad de señal de esta molécula de luciferasa resultan ventajosas en muchos estudios de reporteros. Algunos de los beneficios de usar una molécula informadora secretada como MetLuc es su protocolo de no lisis que permite que uno pueda realizar ensayos de células vivas y múltiples ensayos en la misma célula.

Bacteriano

La bioluminiscencia bacteriana se observa en especies de Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi y Vibrio harveyi . La emisión de luz en algunas bacterias bioluminiscentes utiliza una 'antena' como la proteína lumazina para aceptar la energía del estado excitado primario de la luciferasa, lo que da como resultado un cromóforo excitado de lulnazina que emite luz de una longitud de onda más corta (más azul), mientras que en otras utiliza una proteína fluorescente amarilla (YFP) con FMN como cromóforo y emite luz que se desplaza al rojo en relación con la de la luciferasa.

Dinoflagelado

La luciferasa dinoflagelada es una proteína eucariota de múltiples dominios , que consta de un dominio N-terminal y tres dominios catalíticos , cada uno de los cuales está precedido por un dominio de haz helicoidal. Se ha resuelto la estructura del dominio catalítico de dinoflagelados luciferasa . La parte central del dominio es un barril beta de 10 hebras que es estructuralmente similar a las lipocalinas y FABP . El dominio N-terminal se conserva entre la luciferasa dinoflagelada y las proteínas de unión a luciferina (LBP). Se ha sugerido que esta región puede mediar una interacción entre LBP y luciferasa o su asociación con la membrana vacuolar . El dominio helicoidal paquete tiene una tres hélice paquete de estructura que sostiene cuatro importantes histidinas que se cree que desempeñan un papel en el pH regulación de la enzima . Hay una bolsa grande en el barril β de la dinoflagelado luciferasa a pH 8 para acomodar el sustrato de tetrapirrol , pero no hay abertura para permitir la entrada del sustrato. Por lo tanto, debe ocurrir un cambio conformacional significativo para proporcionar acceso y espacio para un ligando en el sitio activo y la fuente de este cambio es a través de los cuatro residuos de histidina N-terminales. A pH 8, se puede ver que los residuos de histidina no protonadas están involucrados en una red de enlaces de hidrógeno en la interfaz de las hélices en el haz que bloquean el acceso del sustrato al sitio activo y la interrupción de esta interacción por protonación (a pH 6,3). o mediante la sustitución de los residuos de histidina por alanina provoca un gran movimiento molecular del haz, separando las hélices en 11Å y abriendo el sitio catalítico. Lógicamente, los residuos de histidina no pueden ser reemplazados por alanina en la naturaleza, pero este reemplazo experimental confirma además que los residuos de histidina más grandes bloquean el sitio activo. Además, tres secuencias Gly-Gly, una en la hélice N-terminal y dos en el motivo hélice-bucle-hélice, podrían servir como bisagras alrededor de las cuales giran las cadenas para abrir aún más la vía hacia el sitio catalítico y ampliar el activo. sitio.

Una luciferasa dinoflagelada es capaz de emitir luz debido a su interacción con su sustrato ( luciferina ) y la proteína de unión a luciferina (LBP) en el organelo scintillon que se encuentra en los dinoflagelados. La luciferasa actúa de acuerdo con la luciferina y el LBP para emitir luz, pero cada componente funciona a un pH diferente. La luciferasa y sus dominios no son activos a pH 8 pero son extremadamente activos al pH óptimo de 6,3, mientras que la LBP se une a la luciferina a pH 8 y la libera a pH 6,3. En consecuencia, la luciferina solo se libera para reaccionar con una luciferasa activa cuando el escintillón se acidifica a pH 6,3. Por lo tanto, para reducir el pH, se abren canales dependientes de voltaje en la membrana de scintillon para permitir la entrada de protones de una vacuola que posee un potencial de acción producido por una estimulación mecánica. Por lo tanto, se puede ver que el potencial de acción en la membrana vacuolar conduce a la acidificación y esto a su vez permite que la luciferina sea liberada para reaccionar con la luciferasa en el centelleo, produciendo un destello de luz azul.

Mecanismo de reacción

Todas las luciferasas se clasifican como oxidorreductasas ( CE 1.13.12.- ), lo que significa que actúan sobre donantes únicos con incorporación de oxígeno molecular. Debido a que las luciferasas provienen de muchas familias de proteínas diversas que no están relacionadas, no existe un mecanismo unificador, ya que cualquier mecanismo depende de la combinación de luciferasa y luciferina. Sin embargo, se ha demostrado que todas las reacciones luciferasa-luciferina caracterizadas hasta la fecha requieren oxígeno molecular en algún momento.

Luciferasa bacteriana

La reacción catalizada por la luciferasa bacteriana también es un proceso oxidativo:

  • FMNH 2 + O 2 + RCHO → FMN + RCOOH + H 2 O + luz

En la reacción, el oxígeno molecular oxida el mononucleótido de flavina y un aldehído alifático de cadena larga a un ácido carboxílico alifático . La reacción forma un intermedio de hidroxiflavina excitada, que se deshidrata al producto FMN para emitir luz azul verdosa.

Casi toda la energía que entra en la reacción se transforma en luz. La reacción tiene una eficacia del 80% al 90%. En comparación, la bombilla incandescente solo convierte alrededor del 10% de su energía en luz y un LED de 150 lúmenes por vatio (lm / W) convierte el 20% de la energía de entrada en luz visible.

Aplicaciones

Las luciferasas se pueden producir en el laboratorio mediante ingeniería genética para varios propósitos. Los genes de luciferasa se pueden sintetizar e insertar en organismos o transfectar en células. A partir de 2002, los ratones , los gusanos de seda y las patatas son solo algunos de los organismos que ya han sido modificados para producir la proteína.

En la reacción de luciferasa, se emite luz cuando la luciferasa actúa sobre el sustrato de luciferina apropiado . La emisión de fotones puede detectarse mediante un aparato sensible a la luz, como un luminómetro o microscopios ópticos modificados . Esto permite la observación de procesos biológicos. Dado que la excitación de la luz no es necesaria para la bioluminiscencia de la luciferasa, existe una autofluorescencia mínima y, por lo tanto, una fluorescencia prácticamente sin fondo. Por lo tanto, aún se pueden medir con precisión tan solo 0,02 pg utilizando un contador de centelleo estándar .

En la investigación biológica, la luciferasa se usa comúnmente como informadora para evaluar la actividad transcripcional en células que se transfectan con una construcción genética que contiene el gen de luciferasa bajo el control de un promotor de interés. Además, las moléculas proluminiscentes que se convierten en luciferina tras la actividad de una enzima particular pueden usarse para detectar la actividad enzimática en ensayos de luciferasa acoplados o de dos etapas. Dichos sustratos se han utilizado para detectar la actividad de la caspasa y la actividad del citocromo P450 , entre otros.

La luciferasa también se puede usar para detectar el nivel de ATP celular en ensayos de viabilidad celular o para ensayos de actividad quinasa. La luciferasa puede actuar como una proteína sensora de ATP mediante biotinilación . La biotinilación inmovilizará la luciferasa en la superficie celular al unirse a un complejo de estreptavidina - biotina . Esto permite que la luciferasa detecte la salida de ATP de la célula y mostrará de manera efectiva la liberación de ATP en tiempo real a través de la bioluminiscencia. Además, la luciferasa puede hacerse más sensible para la detección de ATP aumentando la intensidad de luminiscencia cambiando ciertos residuos de aminoácidos en la secuencia de la proteína.

Las imágenes de animales completos (denominadas in vivo cuando están vivos o, de otro modo, llamadas imágenes ex vivo ) es una técnica poderosa para estudiar las poblaciones de células en animales vivos, como los ratones. Se pueden diseñar diferentes tipos de células (p. Ej., Células madre de la médula ósea, células T) para que expresen una luciferasa, lo que permite su visualización no invasiva dentro de un animal vivo utilizando una cámara de dispositivo de carga sensible ( cámara CCD ) .Se ha utilizado esta técnica. para seguir la tumorigénesis y la respuesta de los tumores al tratamiento en modelos animales. Sin embargo, los factores ambientales y las interferencias terapéuticas pueden causar algunas discrepancias entre la carga tumoral y la intensidad de la bioluminiscencia en relación con los cambios en la actividad proliferativa. La intensidad de la señal medida por imágenes in vivo puede depender de varios factores, como la absorción de D-luciferina a través del peritoneo, el flujo sanguíneo, la permeabilidad de la membrana celular, la disponibilidad de cofactores, el pH intracelular y la transparencia del tejido suprayacente, además de la cantidad de luciferasa.

La luciferasa es una proteína sensible al calor que se utiliza en estudios sobre desnaturalización de proteínas , probando las capacidades protectoras de las proteínas de choque térmico . Las oportunidades para usar luciferasa continúan expandiéndose.

Ver también

Referencias

enlaces externos

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