Montaje de Gibson - Gibson assembly

El ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular que permite la unión de múltiples fragmentos de ADN en una única reacción isotérmica. Lleva el nombre de su creador, Daniel G. Gibson, quien fue el director de tecnología y cofundador de Codex DNA .

Proceso

Descripción general del ensamblaje de Gibson

Toda la reacción de ensamblaje de Gibson requiere pocos componentes con pequeñas manipulaciones.

El método puede combinar simultáneamente hasta 15 fragmentos de ADN según la identidad de secuencia. Requiere que los fragmentos de ADN contengan ~ 20-40 pares de bases superpuestos con fragmentos de ADN adyacentes. Estos fragmentos de ADN se mezclan con un cóctel de tres enzimas, junto con otros componentes tampón.

Las tres actividades enzimáticas requeridas son: exonucleasa , ADN polimerasa y ADN ligasa .

  • La exonucleasa mastica el ADN del extremo 5 ', por lo que no inhibe la actividad de la polimerasa y permite que la reacción se produzca en un solo proceso. Las regiones monocatenarias resultantes de los fragmentos de ADN adyacentes pueden aparearse.
  • La ADN polimerasa incorpora nucleótidos para rellenar cualquier espacio.
  • La ADN ligasa se une covalentemente al ADN de los segmentos adyacentes, eliminando así cualquier mella en el ADN.

El producto resultante son diferentes fragmentos de ADN unidos en uno. Se pueden ensamblar moléculas circulares lineales o cerradas.

Hay dos enfoques para el ensamblaje de Gibson. Un método de un paso y un método de dos pasos. Ambos métodos se pueden realizar en un solo recipiente de reacción. El método de ensamblaje de Gibson en 1 paso permite el ensamblaje de hasta 5 fragmentos diferentes utilizando un proceso isotérmico de un solo paso . En este método, los fragmentos y una mezcla maestra de enzimas se combinan y toda la mezcla se incuba a 50 ° C durante hasta una hora. Para la creación de construcciones más complejas con hasta 15 fragmentos, o para las construcciones que incorporan fragmentos de 100 pb a 10 kb, se usa el enfoque de dos pasos del ensamblaje de Gibson. La reacción de dos pasos requiere dos adiciones separadas de mezcla maestra; uno para el paso de exonucleasa y hibridación y el segundo para los pasos de ligación y polimerasa de ADN. Para el enfoque de dos pasos, se utilizan diferentes temperaturas de incubación para llevar a cabo el proceso de ensamblaje.

Ventajas

Este método de ensamblaje de ADN tiene muchas ventajas en comparación con la clonación de ligadura / enzima de restricción convencional de ADN recombinante.

  • No es necesaria una digestión de restricción de los fragmentos de ADN después de la PCR. Sin embargo, el vector de la cadena principal se puede digerir o sintetizar mediante PCR.
  • Es más barato y más rápido que los esquemas de clonación convencionales, ya que requiere menos pasos y menos reactivos.
  • No queda ninguna cicatriz en el sitio de restricción entre dos fragmentos de ADN, pero la región entre las hebras dobles y los extremos colgantes es ligeramente susceptible a la mutación cuando la ADN polimerasa cierra los espacios.
  • Se pueden combinar hasta 5 fragmentos de ADN simultáneamente en una reacción de un solo tubo utilizando una mezcla maestra de enzimas de un solo paso.
  • Se pueden combinar hasta 15 fragmentos simultáneamente mediante una reacción de dos pasos. En el enfoque de dos pasos, primero se realizan los pasos de exonucleasa y de apareamiento. A esto le sigue la adición de la ADN polimerasa y la ligasa en un segundo paso.
  • El método de ensamblaje de Gibson también se puede utilizar para mutagénesis dirigida al sitio para incorporar mutaciones específicas del sitio, como inserciones, deleciones y mutaciones puntuales.

Referencias

Más información