Epigenómica - Epigenomics

Para otros usos, consulte Epigenomics (revista) y Epigenomics AG .

La epigenómica es el estudio del conjunto completo de modificaciones epigenéticas del material genético de una célula, conocido como epigenoma . El campo es análogo a la genómica y la proteómica , que son el estudio del genoma y proteoma de una célula. Las modificaciones epigenéticas son modificaciones reversibles en el ADN o las histonas de una célula que afectan la expresión génica sin alterar la secuencia del ADN. El mantenimiento epigenómico es un proceso continuo y juega un papel importante en la estabilidad de los genomas eucariotas al participar en mecanismos biológicos cruciales como la reparación del ADN. Se dice que las flavonas vegetales inhiben las marcas epigenómicas que causan cánceres. Dos de las modificaciones epigenéticas más caracterizadas son la metilación del ADN y la modificación de histonas . Las modificaciones epigenéticas juegan un papel importante en la expresión y regulación génica, y están implicadas en numerosos procesos celulares como la diferenciación / desarrollo y la tumorigénesis . El estudio de la epigenética a nivel mundial sólo ha sido posible recientemente gracias a la adaptación de ensayos genómicos de alto rendimiento.

Introducción a la epigenética

Los mecanismos que gobiernan la plasticidad fenotípica , o la capacidad de una célula para cambiar su estado en respuesta a estímulos, han sido objeto de investigación desde hace mucho tiempo (plasticidad fenotípica 1). El dogma central tradicional de la biología establece que el ADN de una célula se transcribe en ARN , que se traduce en proteínas , que realizan procesos y funciones celulares. Sin embargo, existe una paradoja en que las células exhiben diversas respuestas a diversos estímulos y que las células que comparten conjuntos idénticos de ADN, como en los organismos multicelulares, pueden tener una variedad de funciones y fenotipos distintos. Las opiniones clásicas han atribuido la variación fenotípica a diferencias en la estructura primaria del ADN, ya sea a través de una mutación aberrante o un alelo de secuencia heredado . Sin embargo, si bien esto explica algunos aspectos de la variación, no explica cómo se llevan a cabo las respuestas celulares estrechamente coordinadas y reguladas, como la diferenciación.

Una fuente más probable de plasticidad celular es a través de la regulación de la expresión génica , de modo que mientras dos células pueden tener ADN casi idéntico, la expresión diferencial de ciertos genes da como resultado una variación. La investigación ha demostrado que las células son capaces de regular la expresión génica en varias etapas : transcripción, procesamiento y transporte de ARNm, así como en la traducción de proteínas, procesamiento postraduccional y degradación. Las proteínas reguladoras que se unen al ADN, ARN y / o proteínas son efectores clave en estos procesos y funcionan regulando positiva o negativamente el nivel y la función de proteínas específicas en una célula. Y, aunque los factores de transcripción de unión al ADN proporcionan un mecanismo para el control específico de las respuestas celulares, también es poco probable un modelo en el que los factores de transcripción de unión al ADN sean los únicos reguladores de la actividad genética. Por ejemplo, en un estudio de transferencia nuclear de células somáticas , se demostró que las características estables de diferenciación permanecen después de que el núcleo se transfiere a un nuevo entorno celular, lo que sugiere que un mecanismo estable y hereditario de regulación génica estaba involucrado en el mantenimiento de la estado diferenciado en ausencia de factores de transcripción de unión al ADN.

Con el hallazgo de que la metilación del ADN y las modificaciones de histonas son procesos estables, heredables y también reversibles que influyen en la expresión génica sin alterar la estructura primaria del ADN, se proporcionó un mecanismo para la variabilidad observada en la expresión génica celular. Estas modificaciones se denominaron epigenéticas, por epi "sobre" el material genético "ADN" (Epigenética 1). Los mecanismos que gobiernan las modificaciones epigenéticas son complejos, pero gracias al advenimiento de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento , ahora se comprenden mejor.

Epigenética

Las modificaciones genómicas que alteran la expresión génica que no pueden atribuirse a la modificación de la secuencia de ADN primaria y que son heredables mitótica y meióticamente se clasifican como modificaciones epigenéticas. La metilación del ADN y la modificación de histonas se encuentran entre los procesos epigenéticos mejor caracterizados.

Metilación del ADN

La primera modificación epigenética que se caracterizó en profundidad fue la metilación del ADN. Como su nombre lo indica, la metilación del ADN es el proceso mediante el cual se agrega un grupo metilo al ADN. Las enzimas responsables de catalizar esta reacción son las ADN metiltransferasas (DNMT) . Si bien la metilación del ADN es estable y heredable, puede revertirse mediante un grupo antagonista de enzimas conocidas como ADN desmetilasas. En eucariotas, la metilación se encuentra más comúnmente en la posición del carbono 5 de los residuos de citosina (5mC) adyacentes a la guanina , denominados dinucleótidos CpG .

Los patrones de metilación del ADN varían mucho entre especies e incluso dentro del mismo organismo. El uso de metilación entre animales es bastante diferente; con vertebrados que exhiben los niveles más altos de 5mC e invertebrados niveles más moderados de 5mC. No se ha demostrado que algunos organismos como Caenorhabditis elegans tengan 5mC ni una metiltransferasa de ADN convencional; esto sugeriría que también están implicados otros mecanismos distintos de la metilación del ADN.

Dentro de un organismo, los niveles de metilación del ADN también pueden variar a lo largo del desarrollo y por región. Por ejemplo, en las células germinales primordiales de ratón , incluso se produce una desmetilación de todo el genoma; por etapa de implantación, los niveles de metilación vuelven a sus valores somáticos previos. Cuando la metilación del ADN ocurre en las regiones promotoras , los sitios de inicio de la transcripción, tiene el efecto de reprimir la expresión génica. Esto contrasta con las regiones promotoras no metiladas que están asociadas con genes expresados ​​activamente.

El mecanismo por el cual la metilación del ADN reprime la expresión génica es un proceso de varios pasos. La distinción entre residuos de citosina metilados y no metilados se lleva a cabo mediante proteínas de unión al ADN específicas. La unión de estas proteínas recluta la enzima histona desacetilasa (HDAC) que inicia la remodelación de la cromatina de modo que el ADN se vuelve menos accesible a la maquinaria transcripcional, como la ARN polimerasa , reprimiendo eficazmente la expresión génica.

Modificación de histonas

En eucariotas , el ADN genómico se enrolla en complejos de proteína-ADN llamados cromatina . Las histonas , que son el tipo de proteína más prevalente que se encuentra en la cromatina, funcionan para condensar el ADN; la carga neta positiva de las histonas facilita su unión con el ADN, que está cargado negativamente. Las unidades básicas y repetidas de la cromatina, los nucleosomas , consisten en un octámero de proteínas histonas (H2A, H2B, H3 y H4) y una longitud de ADN de 146 pb envuelto alrededor. Los nucleosomas y el ADN que se conectan forman una fibra de cromatina de 10 nm de diámetro, que se puede condensar aún más.

El empaquetamiento de cromatina del ADN varía según la etapa del ciclo celular y la región del ADN local. El grado en que se condensa la cromatina está asociado con un cierto estado transcripcional. La cromatina suelta o no empaquetada es más transcripcionalmente activa que la cromatina empaquetada de manera compacta porque es más accesible a la maquinaria transcripcional. Remodelando la estructura de la cromatina y cambiando la densidad del empaquetamiento del ADN, la expresión génica se puede modular así.

La remodelación de la cromatina se produce mediante modificaciones postraduccionales de las colas N-terminales de las proteínas histonas centrales . El conjunto colectivo de modificaciones de histonas en una célula determinada se conoce como código de histonas . Se conocen muchos tipos diferentes de modificación de histonas, que incluyen: acetilación , metilación , fosforilación , ubiquitinación , SUMOilación , ADP-ribosilación , desaminación e isomerización de prolina ; La acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación se han implicado en la activación génica, mientras que la metilación, ubiquitinación, SUMOilación, desiminación e isomerización de prolina se han implicado en la represión génica. Tenga en cuenta que varios tipos de modificación, que incluyen metilación, fosforilación y ubiquitinación, pueden asociarse con diferentes estados transcripcionales dependiendo del aminoácido específico de la histona que se está modificando. Además, la región de ADN donde se produce la modificación de histonas también puede provocar diferentes efectos; un ejemplo es la metilación de la histona del tercer núcleo en el residuo de lisina 36 (H3K36). Cuando H3K36 ocurre en las secciones codificantes de un gen, está asociado con la activación del gen, pero ocurre lo contrario cuando está dentro de la región promotora.

Las modificaciones de histonas regulan la expresión génica mediante dos mecanismos: mediante la interrupción del contacto entre nucleosomas y mediante el reclutamiento de ATPasas remodeladoras de cromatina . Un ejemplo del primer mecanismo ocurre durante la acetilación de los aminoácidos de la cola del terminal de lisina , que es catalizada por las histonas acetiltransferasas (HAT) . Los HAT son parte de un complejo multiproteico que se recluta a la cromatina cuando los activadores se unen a los sitios de unión del ADN. La acetilación neutraliza eficazmente la carga básica de la lisina, que participó en la estabilización de la cromatina a través de su afinidad por el ADN cargado negativamente. Por tanto, las histonas acetiladas favorecen la disociación de los nucleosomas y, por tanto, puede producirse el desenrollamiento de la cromatina. En un estado de cromatina suelta, el ADN es más accesible a la maquinaria transcripcional y, por lo tanto, se activa la expresión. El proceso se puede revertir mediante la eliminación de grupos acetilo de histonas por desacetilasas.

El segundo proceso implica el reclutamiento de complejos remodeladores de cromatina mediante la unión de moléculas activadoras a las correspondientes regiones potenciadoras. Los complejos de remodelación de nucleosomas reposicionan los nucleosomas mediante varios mecanismos, lo que permite o deshabilita la accesibilidad de la maquinaria transcripcional al ADN. El complejo proteico SWI / SNF en levadura es un ejemplo de complejo remodelador de cromatina que regula la expresión de muchos genes a través del remodelado de cromatina.

Relación con otros campos genómicos

La epigenómica comparte muchos puntos en común con otros campos de la genómica, tanto en metodología como en su propósito abstracto. La epigenómica busca identificar y caracterizar modificaciones epigenéticas a nivel global, similar al estudio del conjunto completo de ADN en genómica o el conjunto completo de proteínas en una célula en proteómica. La lógica detrás de la realización de análisis epigenéticos a nivel global es que se pueden hacer inferencias sobre modificaciones epigenéticas, que de otro modo no serían posibles mediante el análisis de loci específicos. Al igual que en los otros campos de la genómica, la epigenómica se basa en gran medida en la bioinformática , que combina las disciplinas de la biología, las matemáticas y la informática. Sin embargo, si bien las modificaciones epigenéticas se conocían y estudiaban durante décadas, es a través de estos avances en la tecnología bioinformática que han permitido realizar análisis a escala global. Muchas técnicas actuales todavía se basan en métodos más antiguos, a menudo adaptándolos a ensayos genómicos como se describe en la siguiente sección.

Métodos

Ensayos de modificación de histonas

Los procesos celulares de transcripción , replicación y reparación del ADN implican la interacción entre el ADN genómico y las proteínas nucleares. Se sabía que ciertas regiones de la cromatina eran extremadamente susceptibles a la digestión de la ADNasa I , que escinde el ADN con una especificidad de secuencia baja. Se pensó que tales sitios hipersensibles eran regiones transcripcionalmente activas, como lo demuestra su asociación con la ARN polimerasa y las topoisomerasas I y II .

Ahora se sabe que la sensibilidad a las regiones de ADNasa I corresponden a regiones de cromatina con asociación de ADN-histona suelta. Los sitios hipersensibles suelen representar regiones promotoras, que requieren que el ADN sea accesible para que funcione la maquinaria transcripcional de unión al ADN.

ChIP-Chip y ChIP-Seq

La modificación de histonas se detectó por primera vez en un nivel amplio del genoma mediante el acoplamiento de la tecnología de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con microarrays de ADN , denominados ChIP-Chip . Sin embargo, en lugar de aislar un factor de transcripción de unión al ADN o una proteína potenciadora mediante inmunoprecipitación de cromatina, las proteínas de interés son las propias histonas modificadas. Primero, las histonas se entrecruzan con el ADN in vivo mediante un tratamiento químico ligero (p. Ej., Formaldehído ). A continuación, las células se lisan, lo que permite extraer y fragmentar la cromatina, ya sea mediante sonicación o tratamiento con una enzima de restricción no específica (por ejemplo, nucleasa microcócica ). Los anticuerpos específicos de modificación, a su vez, se utilizan para inmunoprecipitar los complejos de ADN-histona. Después de la inmunoprecipitación, el ADN se purifica a partir de las histonas, se amplifica mediante PCR y se marca con una etiqueta fluorescente (por ejemplo, Cy5, Cy3 ). El paso final implica la hibridación del ADN marcado, tanto el ADN inmunoprecipitado como el no inmunoprecipitado, en una micromatriz que contiene ADNg inmovilizado. El análisis de la intensidad de la señal relativa permite determinar los sitios de modificación de las histonas.

ChIP-chip se utilizó ampliamente para caracterizar los patrones globales de modificación de histonas de levadura . A partir de estos estudios, se hicieron inferencias sobre la función de las modificaciones de las histonas; que la activación o represión transcripcional se asoció con ciertas modificaciones de histonas y por región. Si bien este método fue eficaz al proporcionar una cobertura casi completa del epigenoma de la levadura, su uso en genomas más grandes, como los humanos, es limitado.

Para estudiar las modificaciones de las histonas a un nivel verdaderamente del genoma, se combinaron otros métodos de alto rendimiento con la inmunoprecipitación de cromatina, a saber: SAGE: análisis en serie de la expresión génica (ChIP-SAGE), PET: secuenciación de ditag de extremos emparejados ( ChIP-PET ) y más recientemente, secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq) . ChIP-seq sigue el mismo protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina, pero en lugar de la amplificación del ADN purificado y la hibridación en una micromatriz, los fragmentos de ADN se secuencian directamente utilizando una nueva secuenciación en paralelo de próxima generación. Ha demostrado ser un método eficaz para analizar los patrones de modificación de histonas globales y los sitios objetivo de las proteínas, proporcionando una resolución más alta que los métodos anteriores.

Ensayos de metilación de ADN

Las técnicas para caracterizar las secuencias de ADN primarias no se pueden aplicar directamente a los ensayos de metilación. Por ejemplo, cuando el ADN se amplificó mediante PCR o técnicas de clonación bacteriana, el patrón de metilación no se copió y, por lo tanto, se perdió la información. La técnica de hibridación de ADN utilizada en los ensayos de ADN, en la que se usaron sondas radiactivas para mapear e identificar secuencias de ADN, no pudo usarse para distinguir entre ADN metilado y no metilado.

Métodos basados ​​en endonucleasas de restricción

Enfoques que no abarcan todo el genoma

Los primeros ensayos de detección de metilación utilizaron endonucleasas de restricción sensibles a la modificación de metilación . El ADN genómico se digirió con enzimas de restricción sensibles e insensibles a la metilación que reconocen el mismo sitio de restricción. La idea era que siempre que se metilara el sitio, solo la enzima insensible a la metilación podría escindir en esa posición. Comparando los tamaños de los fragmentos de restricción generados a partir de la enzima sensible a la metilación con los de la enzima insensible a la metilación, fue posible determinar el patrón de metilación de la región. Este paso de análisis se realizó amplificando los fragmentos de restricción mediante PCR, separándolos mediante electroforesis en gel y analizándolos mediante Southern blot con sondas para la región de interés.

Esta técnica se utilizó para comparar los patrones de modificación de la metilación del ADN en los loci del gen de la hemoglobina y del adulto humano . Se sabía que diferentes regiones del gen (gamma delta beta globina) se expresaban en diferentes etapas de desarrollo. De acuerdo con el papel de la metilación del ADN en la represión de genes, las regiones que se asociaron con altos niveles de metilación del ADN no se expresaron activamente.

Este método se limitó a no ser adecuado para estudios sobre el patrón de metilación global o 'metiloma'. Incluso dentro de loci específicos, no era completamente representativo del patrón de metilación verdadero, ya que solo aquellos sitios de restricción con los correspondientes ensayos de restricción sensibles e insensibles a la metilación podrían proporcionar información útil. Podrían surgir más complicaciones cuando la digestión incompleta del ADN por las enzimas de restricción generara resultados negativos falsos.

Enfoques amplios del genoma

El perfil de metilación del ADN a gran escala se hizo posible por primera vez a través de la técnica Restriction Landmark Genome Scanning (RLGS) . Al igual que el ensayo de metilación de ADN específico de locus, la técnica identificó el ADN metilado a través de sus enzimas sensibles a la metilación de digestión. Sin embargo, fue el uso de la electroforesis en gel bidimensional lo que permitió caracterizar a una escala más amplia.

Sin embargo, no fue hasta el advenimiento de los microarrays y la tecnología de secuenciación de próxima generación cuando se hizo posible la metilación del ADN de una resolución verdaderamente alta y de todo el genoma. Al igual que con RLGS, el componente de endonucleasa se retiene en el método pero está acoplado a nuevas tecnologías. Uno de estos enfoques es la hibridación por metilación diferencial (DMH), en la que un conjunto de ADN genómico se digiere con enzimas de restricción sensibles a la metilación y no se digiere un conjunto paralelo de ADN. Ambos conjuntos de ADN se amplifican posteriormente y cada uno se marca con tintes fluorescentes y se utiliza en la hibridación de matriz de dos colores. El nivel de metilación del ADN en un loci dado está determinado por las relaciones de intensidad relativa de los dos colorantes. La adaptación de la secuenciación de próxima generación al ensayo de metilación del ADN proporciona varias ventajas sobre la hibridación de matrices. La tecnología basada en secuencias proporciona una resolución más alta para la metilación de ADN específica de alelos, se puede realizar en genomas más grandes y no requiere la creación de microarrays de ADN que requieren ajustes basados ​​en la densidad de CpG para funcionar correctamente.

Secuenciación de bisulfito

La secuenciación de bisulfito se basa exclusivamente en la conversión química de citosinas no metiladas, de modo que puedan identificarse mediante técnicas de secuenciación de ADN estándar. El tratamiento con bisulfato de sodio y alcalino hace esto al convertir los residuos de citosina no metilada en uracilo sin alterar la citosina metilada. La posterior amplificación y secuenciación del ADN no tratado y del ADN tratado con bisulfito de sodio permite identificar los sitios metilados. La secuenciación de bisulfito, al igual que los métodos tradicionales basados ​​en la restricción, se limitaba históricamente a los patrones de metilación de loci de genes específicos, hasta que se dispuso de tecnologías de secuenciación del genoma completo. Sin embargo, a diferencia de los métodos tradicionales basados ​​en la restricción, la secuenciación de bisulfito proporcionó resolución a nivel de nucleótidos.

Las limitaciones de la técnica del bisulfito incluyen la conversión incompleta de citosina en uracilo, que es una fuente de falsos positivos. Además, el tratamiento con bisulfito también provoca la degradación del ADN y requiere un paso de purificación adicional para eliminar el bisulfito de sodio.

La secuenciación de próxima generación es muy adecuada para complementar la secuenciación de bisulfito en el análisis de metilación de todo el genoma . Si bien esto ahora permite determinar el patrón de metilación con la resolución más alta posible, en el nivel de un solo nucleótido, aún quedan desafíos en el paso de ensamblaje debido a la menor complejidad de la secuencia en el ADN tratado con bisulfito. Los aumentos en la longitud de lectura buscan abordar este desafío, lo que permite realizar la secuenciación de bisulfito de escopeta de genoma completo (WGBS). El enfoque WGBS utilizando una plataforma Illumina Genome Analyzer y ya se ha implementado en Arabidopsis thaliana . También existen métodos genómicos de representación reducida basados ​​en la secuenciación de bisulfito, y son particularmente adecuados para especies con genomas de gran tamaño.

Ensayos de accesibilidad a la cromatina

La accesibilidad a la cromatina es la medida de cuán "accesible" o "abierta" es una región del genoma a la transcripción o unión de factores de transcripción. Las regiones que son inaccesibles (es decir, porque están unidas por nucleosomas ) no son transcritas activamente por la célula, mientras que las regiones abiertas y accesibles se transcriben activamente. Los cambios en la accesibilidad de la cromatina son procesos reguladores epigenéticos importantes que gobiernan la expresión de genes específica de la célula o el contexto. Los ensayos como MNase-seq, DNase-seq, ATAC-seq o FAIRE-seq se utilizan de forma rutinaria para comprender el panorama de cromatina accesible de las células. La característica principal de todos estos métodos es que pueden aislar selectivamente las secuencias de ADN que están unidas a las histonas o las que no lo están. A continuación, estas secuencias se comparan con un genoma de referencia que permite identificar su posición relativa.

MNase-seq y DNase-seq siguen los mismos principios, ya que emplean enzimas líticas que se dirigen a los ácidos nucleicos para cortar las hebras de ADN no unidas por nucleosomas u otros factores proteicos, mientras que las piezas unidas están protegidas y pueden recuperarse y analizarse. Dado que las regiones activas no unidas se destruyen, su detección solo puede ser indirecta, mediante la secuenciación con una técnica de secuenciación de próxima generación y la comparación con una referencia. MNase-seq utiliza una nucleasa microcócica que produce una escisión de una sola hebra en la hebra opuesta de la secuencia diana. DNase-seq emplea DNasa I , una endonucleasa de escisión de doble hebra no específica. Esta técnica se ha utilizado hasta tal punto que las regiones libres de nucleosomas se han etiquetado como DHS, sitios hipersensibles a la DNasa I, y ha sido el método de elección del consorcio ENCODE para los análisis de accesibilidad a la cromatina en todo el genoma. El problema principal de esta técnica es que la distribución de clivaje puede estar sesgada, lo que reduce la calidad de los resultados.

FAIRE-seq (Aislamiento de elementos reguladores asistido por formaldehído) requiere como primer paso el entrecruzamiento del ADN con nucleosomas, luego el corte del ADN por sonicación . Los fragmentos libres y enlazados se separan con una extracción tradicional con fenol-cloroformo, ya que la fracción proteica se pega en la interfase mientras que el ADN no enlazado pasa a la fase acuosa y se puede analizar con varios métodos. La sonicación produce roturas aleatorias y, por lo tanto, no está sujeta a ningún tipo de sesgo, y también la mayor longitud de los fragmentos (200-700 nt) hace que esta técnica sea adecuada para regiones más amplias, mientras que no puede resolver el nucleosoma individual. A diferencia de los métodos basados ​​en nucleasas, FAIRE-seq permite la identificación directa de los sitios transcripcionalmente activos y una preparación de la muestra menos laboriosa.

ATAC-seq se basa en la actividad de la transposasa Tn5. La transposasa se usa para insertar etiquetas en el genoma, con mayor frecuencia en regiones no cubiertas por factores proteicos. Las etiquetas se utilizan luego como adaptadores para PRC u otras herramientas analíticas.

Detección directa

La sensibilidad de la polimerasa en la secuenciación en tiempo real de una sola molécula hizo posible que los científicos detectaran directamente marcas epigenéticas como la metilación a medida que la polimerasa se mueve a lo largo de la molécula de ADN que se está secuenciando. Varios proyectos han demostrado la capacidad de recopilar datos epigenéticos de todo el genoma en bacterias.

La secuenciación de nanoporos se basa en cambios de señales de corriente electrolítica de acuerdo con modificaciones de base (por ejemplo, metilación). Una polimerasa media la entrada de ssDNA en el poro: la variación de la corriente iónica es modulada por una sección del poro y la diferencia generada consecuentemente se registra revelando la posición de CpG . La discriminación entre hidroximetilación y metilación es posible gracias a los nanoporos en estado sólido, incluso si la corriente que pasa a través de la región de campo alto del poro puede verse ligeramente influenciada en ella. Como referencia se utiliza ADN amplificado que no presentará sitios de metilación copiados después del proceso de PCR . El secuenciador MinION de Oxford Nanopore Technologies es una tecnología donde, según un modelo oculto de Markov , es posible distinguir la citosina no metilada de la metilada incluso sin un tratamiento químico que actúe para potenciar la señal de esa modificación. Los datos se registran comúnmente en picoamperios durante el tiempo establecido. Otros dispositivos son el Nanopolish y el SignaAlign: el primero expresa la frecuencia de una metilación en una lectura, mientras que el segundo da una probabilidad de que se derive de la suma de todas las lecturas.

La secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT) es un método de secuenciación de ADN de una sola molécula. La secuenciación en tiempo real de una sola molécula utiliza una guía de ondas de modo cero (ZMW). Una sola enzima ADN polimerasa se une a la parte inferior de una ZMW con una sola molécula de ADN como plantilla. Cada una de las cuatro bases de ADN está unida a uno de los cuatro tintes fluorescentes diferentes . Cuando la ADN polimerasa incorpora un nucleótido, la etiqueta fluorescente se escinde y el detector detecta la señal fluorescente de la incorporación del nucleótido. A medida que ocurre la secuenciación, la cinética de la enzima polimerasa cambia cuando encuentra una región de metilación o cualquier otra modificación de base. Cuando la enzima encuentra bases químicamente modificadas, se ralentizará o acelerará de una manera identificable de forma única. Los pulsos de fluorescencia en la secuenciación SMRT se caracterizan no solo por sus espectros de emisión sino también por su duración y por el intervalo entre pulsos sucesivos. Estas métricas, definidas como ancho de pulso y duración entre pulsos (IPD), agregan información valiosa sobre la cinética de la ADN polimerasa. El ancho del pulso es una función de todos los pasos cinéticos después de la unión de nucleótidos y hasta la liberación del fluoróforo, y la IPD está determinada por la cinética de la unión de nucleótidos y la translocación de la polimerasa.

En 2010, un equipo de científicos demostró el uso de secuenciación en tiempo real de una sola molécula para la detección directa de nucleótidos modificados en la plantilla de ADN, incluidas N6-metiladenosina , 5-metilcitosina y 5-hidroxilcitosina . Estas diversas modificaciones afectan la cinética de la polimerasa de manera diferente, lo que permite la discriminación entre ellas.

En 2017, otro equipo propuso una conversión combinada de bisulfito con secuenciación en tiempo real de molécula única de tercera generación, se denomina secuenciación de bisulfito en tiempo real de molécula única (SMRT-BS), que es un método preciso de análisis de metilación de CpG dirigido capaz de un alto grado de multiplicación y longitudes de lectura largas (1,5 kb) sin la necesidad de subclonación de amplicones por PCR.

Enfoques de modelado teórico

Los primeros modelos matemáticos para diferentes estados de nucleosomas que afectan la expresión génica se introdujeron en la década de 1980 [ref]. Más tarde, esta idea fue casi olvidada, hasta que la evidencia experimental indicó un posible papel de las modificaciones de las histonas covalentes como código epigenético . En los próximos años, los datos de alto rendimiento han descubierto la abundancia de modificaciones epigenéticas y su relación con el funcionamiento de la cromatina, lo que ha motivado nuevos modelos teóricos para la aparición, el mantenimiento y el cambio de estos patrones. Estos modelos generalmente se formulan en el marco de enfoques de celosía unidimensionales.

Ver también

Notas

Referencias

  • Gibson G, Muse SV (2009). Una cartilla de Genome Science (3ª ed.). Sunderland: Asociados de Sinaeur. ISBN 978-0-87893-236-8.
  • Russell PJ (2010). iGenetics: A Molecular Approach (3ª ed.). San Francisco: Pearson Benjamin Cummings. ISBN 978-0-321-56976-9.

Otras lecturas