Centrifugación - Centrifugation

La centrifugación es un proceso mecánico que implica el uso de la fuerza centrífuga para separar las partículas de una solución de acuerdo con su tamaño, forma, densidad, viscosidad media y velocidad del rotor. Los componentes más densos de la mezcla migran alejándose del eje de la centrífuga , mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Los químicos y biólogos pueden aumentar la fuerza gravitacional efectiva del tubo de ensayo para que el precipitado (gránulo) viaje rápida y completamente hasta el fondo del tubo. El líquido restante que se encuentra por encima del precipitado se denomina sobrenadante o sobrenadante.

Existe una correlación entre el tamaño y la densidad de una partícula y la velocidad a la que la partícula se separa de una mezcla heterogénea, cuando la única fuerza aplicada es la de la gravedad. Cuanto mayor sea el tamaño y la densidad de las partículas, más rápido se separan de la mezcla. Al aplicar una fuerza gravitacional efectiva mayor a la mezcla, como lo hace una centrífuga, se acelera la separación de las partículas. Esto es ideal en entornos industriales y de laboratorio porque las partículas que se separarían naturalmente durante un largo período de tiempo se pueden separar en mucho menos tiempo.

La velocidad de centrifugación se especifica mediante la velocidad angular, que generalmente se expresa como revoluciones por minuto (RPM), o la aceleración expresada como g . El factor de conversión entre RPM yg depende del radio del rotor de la centrífuga . La velocidad de sedimentación de las partículas en la centrifugación es función de su tamaño y forma, la aceleración centrífuga, la fracción de volumen de sólidos presentes, la diferencia de densidad entre la partícula y el líquido y la viscosidad . La aplicación más común es la separación de sólidos de suspensiones altamente concentradas, que se utiliza en el tratamiento de lodos de depuradora para deshidratación donde se producen sedimentos menos consistentes.

El método de centrifugación tiene una amplia variedad de aplicaciones industriales y de laboratorio; Este proceso no solo se utiliza para separar dos sustancias miscibles, sino también para analizar las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas. Es uno de los métodos de investigación más importantes y de uso común en bioquímica , biología celular y molecular . En las industrias química y alimentaria, las centrifugadoras especiales pueden procesar una corriente continua de líquido cargado de partículas. La centrifugación es también el método más común utilizado para el enriquecimiento de uranio , basándose en la ligera diferencia de masa entre los átomos de U-238 y U-235 en el gas hexafluoruro de uranio .

Fórmula matemática

En una suspensión líquida, muchas partículas o células caerán gradualmente al fondo del recipiente debido a la gravedad ; sin embargo, la cantidad de tiempo necesaria para tales separaciones no es factible. Otras partículas, que son muy pequeñas, no se pueden aislar en absoluto en solución hasta que se exponen a una gran fuerza centrífuga . A medida que la suspensión gira a una determinada velocidad o revoluciones por minuto (RPM), la fuerza centrífuga permite que las partículas se desplacen radialmente alejándose del eje de rotación. La fórmula general para calcular las revoluciones por minuto (RPM) de una centrífuga es:

${\ Displaystyle RPM = {\ sqrt {g \ over r}}}$,

donde g representa la fuerza respectiva de la centrífuga y r el radio desde el centro del rotor hasta un punto de la muestra.

Sin embargo, dependiendo del modelo de centrífuga utilizado, el ángulo respectivo del rotor y el radio pueden variar, por lo que la fórmula se modifica. Por ejemplo, el rotor Sorvall # SS-34 tiene un radio máximo de 10,8 cm, por lo que la fórmula se convierte en , que puede simplificarse aún más . ${\ textstyle RPM = 299 {\ sqrt {g \ over r}}}$${\ textstyle RPM = 91 {\ sqrt {g}}}$

Cuando se compara con la gravedad, la fuerza de las partículas se denomina "Fuerza centrífuga relativa" (RCF). Es la fuerza perpendicular ejercida sobre el contenido del rotor como resultado de la rotación, siempre relativa a la gravedad de la tierra, que mide la fuerza de rotores de diferentes tipos y tamaños. Por ejemplo, el RCF de 1000 xg significa que la fuerza centrífuga es 1000 veces más fuerte que la fuerza gravitacional terrestre. RCF depende de la velocidad de rotación en rpm y la distancia de las partículas desde el centro de rotación. La fórmula más común utilizada para calcular RCF es:

${\ displaystyle RCF = 1,118 \ times 10 ^ {- 5} \ times r \ times (rpm) ^ {2}}$,

donde es una constante; r es el radio, expresado en centímetros , entre el eje de rotación y el centro; y rpm es la velocidad en revoluciones por minuto. ${\ textstyle 1.118 \ times 10 ^ {- 5}}$

Históricamente, muchas separaciones se han realizado a una velocidad de 3000 rpm; Una guía aproximada de la fuerza 'g' ejercida a esta velocidad es multiplicar el radio de centrifugación por un factor de 10, por lo que un radio de 160 mm da aproximadamente 1600 x g. Este es un enfoque bastante arbitrario, ya que el RCF aplicado depende linealmente del radio, por lo que un radio 10% más grande significa que se aplica un RCF 10% más alto a la misma velocidad. Aproximadamente, la fórmula anterior se puede simplificar a , con un error de solo 0,62%. ${\ textstyle RCF = 10 \ times r}$

Centrifugación en la investigación biológica

Microcentrífugas

Las microcentrífugas son modelos de sobremesa especialmente diseñados con rotores ligeros de pequeño volumen capaces de una aceleración muy rápida de hasta aproximadamente 17.000 rpm. Son dispositivos livianos que se utilizan principalmente para la centrifugación a corto plazo de muestras de hasta aproximadamente 0,2 a 2,0 ml. Sin embargo, debido a su pequeña escala, son fácilmente transportables y, si es necesario, pueden operarse en una cámara fría. Se pueden refrigerar o no. La microcentrífuga se usa normalmente en laboratorios de investigación donde se requieren pequeñas muestras de moléculas biológicas, células o núcleos para someterlas a RCF alta durante intervalos de tiempo relativamente cortos. Las microcentrífugas diseñadas para un funcionamiento a alta velocidad pueden alcanzar hasta 35000 rpm, dando RCF hasta 30000 × g, y se denominan microcentrífugas de alta velocidad.

Centrífugas de baja velocidad

Las centrífugas de baja velocidad se utilizan para recolectar precipitados químicos, células intactas (animales, plantas y algunos microorganismos), núcleos, cloroplastos, mitocondrias grandes y los fragmentos más grandes de la membrana plasmática. Los gradientes de densidad para purificar células también se procesan en estas centrifugadoras. Los rotores de cubeta oscilante tienden a utilizarse de manera muy generalizada debido a la enorme flexibilidad del tamaño de la muestra mediante el uso de adaptadores. Estas máquinas tienen velocidades máximas de rotor de menos de 10 000 rpm y varían desde centrífugas pequeñas de sobremesa hasta grandes centrífugas de suelo.

Centrifugadoras de alta velocidad

Las centrífugas de alta velocidad se utilizan típicamente para recolectar microorganismos, virus , mitocondrias , lisosomas , peroxisomas y membranas de Golgi tubulares intactas. La mayoría de las tareas simples de granulación se realizan en rotores de ángulo fijo. Algunos trabajos de gradiente de densidad para purificar células y orgánulos se pueden realizar en rotores de cubeta basculante o, en el caso de gradientes de Percoll, en rotores de ángulo fijo. Las centrífugas de alta velocidad o supervelocidad pueden manejar volúmenes de muestra más grandes, desde unas pocas decenas de mililitros hasta varios litros. Además, las centrífugas más grandes también pueden alcanzar velocidades angulares más altas (alrededor de 30.000 rpm). Los rotores pueden venir con diferentes adaptadores para contener varios tamaños de tubos de ensayo , botellas o placas de microtitulación .

Ultracentrifugaciones

La ultracentrifugación hace uso de una alta fuerza centrífuga para estudiar las propiedades de las partículas biológicas a velocidades excepcionalmente altas. Las ultracentrífugas actuales pueden girar hasta 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 xg). Se utilizan para recolectar todas las vesículas de membrana derivadas de la membrana plasmática, el retículo endoplásmico (RE) y la membrana de Golgi , endosomas , ribosomas , subunidades ribosómicas, plásmidos , ADN , ARN y proteínas en rotores de ángulo fijo. En comparación con las microcentrífugas o las centrífugas de alta velocidad, las ultracentrifugadoras pueden aislar partículas mucho más pequeñas y, además, mientras que las microcentrifugadoras y supercentrifugadoras separan las partículas en lotes (volúmenes limitados de muestras deben manipularse manualmente en tubos de ensayo o botellas), las ultracentrifugadoras pueden separar moléculas en lotes o sistemas de flujo continuo.

La ultracentrifugación se emplea para la separación de estudios cinéticos de unión de macromoléculas / ligandos, la separación de varias fracciones de lipoproteínas del plasma y la desprotonización de fluidos fisiológicos para el análisis de aminoácidos.

Son la centrífuga más comúnmente utilizada para la purificación de gradiente de densidad de todas las partículas excepto las células, y aunque los cubos oscilantes se han utilizado tradicionalmente para este propósito, también se utilizan rotores de ángulo fijo y rotores verticales, especialmente para gradientes autogenerados y pueden mejorar la eficiencia de la separación en gran medida. Hay dos tipos de ultracentrífugas: las analíticas y las preparativas.

Ultracentrifugación analítica

La ultracentrifugación analítica (AUC) se puede utilizar para determinar las propiedades de las macromoléculas como la forma, masa, composición y conformación. Es una técnica de análisis biomolecular comúnmente utilizada para evaluar la pureza de la muestra, caracterizar los mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de complejos biomoleculares , determinar estequiometrías de subunidades , identificar y caracterizar cambios conformacionales macromoleculares y calcular constantes de equilibrio y parámetros termodinámicos para la autoasociación. y sistemas de heteroasociación. Las ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección óptica basado en luz visible / ultravioleta de escaneo para monitorear en tiempo real el progreso de la muestra durante un centrifugado.

Las muestras se centrifugan con una solución de alta densidad como sacarosa , cloruro de cesio o iodixanol . La solución de alta densidad puede tener una concentración uniforme en todo el tubo de ensayo ("cojín") o una concentración variable (" gradiente "). Propiedades moleculares pueden modelarse a través de sedimentación análisis de la velocidad o el análisis de equilibrio de sedimentación. Durante la ejecución, la partícula o moléculas migrarán a través del tubo de ensayo a diferentes velocidades dependiendo de sus propiedades físicas y las propiedades de la solución, y eventualmente formarán un gránulo en el fondo del tubo, o bandas a varias alturas.

Ultracentrifugación preparativa

Las ultracentrífugas preparativas se utilizan a menudo para separar partículas de acuerdo con sus densidades, aislar y / o recolectar partículas más densas para su recolección en el gránulo y clarificar suspensiones que contienen partículas. A veces, los investigadores también utilizan ultracentrífugas preparativas si necesitan flexibilidad para cambiar el tipo de rotor en el instrumento. Las ultracentrífugas preparativas pueden equiparse con una amplia gama de diferentes tipos de rotor, que pueden hacer girar muestras de diferentes números, en diferentes ángulos y a diferentes velocidades.

Proceso de fraccionamiento

En la investigación biológica, el fraccionamiento celular generalmente incluye el aislamiento de componentes celulares mientras se retienen las funciones individuales de cada componente. Generalmente, la muestra de células se almacena en una suspensión que es:

• Tamponado: pH neutro, que previene el daño a la estructura de las proteínas, incluidas las enzimas (que podrían afectar los enlaces iónicos).
• Isotónico (de igual potencial hídrico): evita la ganancia o pérdida de agua por parte de los orgánulos.
• Frío: reduce la actividad general de la enzima liberada más adelante en el procedimiento.

La centrifugación es el primer paso en la mayoría de los fraccionamientos . Mediante la centrifugación a baja velocidad, se pueden eliminar los restos celulares, dejando un sobrenadante que preserva el contenido de la célula. La centrifugación repetida a velocidades progresivamente más altas fraccionará los homogeneizados de células en sus componentes. En general, cuanto menor es el componente subcelular, mayor es la fuerza centrífuga necesaria para sedimentarlo. La fracción soluble de cualquier lisado puede luego separarse adicionalmente en sus constituyentes usando una variedad de métodos.

Centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial es el método más simple de fraccionamiento por centrifugación, comúnmente utilizado para separar orgánulos y membranas que se encuentran en las células. Los orgánulos generalmente difieren entre sí en densidad en tamaño, lo que hace posible el uso de la centrifugación diferencial y la centrifugación en general. Los orgánulos se pueden identificar probando indicadores que son exclusivos de los orgánulos específicos. La aplicación más utilizada de esta técnica es producir fracciones subcelulares crudas a partir de un homogeneizado de tejido como el del hígado de rata. Las partículas de diferentes densidades o tamaños en una suspensión se sedimentan a diferentes velocidades, y las partículas más grandes y densas sedimentan más rápido. Estas velocidades de sedimentación se pueden aumentar mediante el uso de fuerza centrífuga.

Una suspensión de células se somete a una serie de ciclos de fuerza centrífuga crecientes para producir una serie de gránulos que comprenden células con una velocidad de sedimentación decreciente. El homogeneizado incluye núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática y una amplia gama de vesículas derivadas de varios compartimentos de la membrana intracelular y también de la membrana plasmática, típicamente en un medio tamponado.

Centrifugación en gradiente de densidad

Se sabe que la centrifugación en gradiente de densidad es uno de los métodos más eficaces para separar partículas suspendidas y se utiliza tanto como técnica de separación como método para medir la densidad de partículas o moléculas en una mezcla.

Se utiliza para separar partículas en función del tamaño, la forma y la densidad utilizando un medio de densidades graduadas. Durante una centrifugación relativamente corta o lenta, las partículas se separan por tamaño, y las partículas más grandes se sedimentan más lejos que las más pequeñas. Durante una centrifugación larga o rápida, las partículas viajan a lugares en el gradiente donde la densidad del medio es la misma que la densidad de las partículas; (ρp - ρm) → 0. Por lo tanto, una partícula pequeña y densa inicialmente sedimenta con menos facilidad que una partícula grande de baja densidad. Las partículas grandes alcanzan temprano su posición de densidad de equilibrio, mientras que las partículas pequeñas migran lentamente a través de la zona de partículas grandes y finalmente toman una posición de equilibrio más profunda en el gradiente.

Un tubo, después de ser centrifugado por este método, tiene partículas en orden de densidad según la altura. El objeto o partícula de interés residirá en la posición dentro del tubo correspondiente a su densidad. Sin embargo, aún son posibles algunas sedimentaciones no ideales cuando se utiliza este método. El primer problema potencial es la agregación no deseada de partículas, pero esto puede ocurrir en cualquier centrifugación. La segunda posibilidad ocurre cuando se sedimentan gotas de solución que contienen partículas. Es más probable que esto ocurra cuando se trabaja con una solución que tiene una capa de suspensión flotando sobre un líquido denso, que de hecho tiene poco o ningún gradiente de densidad.

Otras aplicaciones

Se puede usar una centrífuga para aislar pequeñas cantidades de sólidos retenidos en suspensión de líquidos, como en la separación de tiza en polvo del agua. En investigación biológica, se puede utilizar en la purificación de células de mamíferos, fraccionamiento de orgánulos subcelulares, fraccionamiento de vesículas de membrana, fraccionamiento de macromoléculas y complejos macromoleculares, etc. La centrifugación se utiliza de muchas formas diferentes en la industria alimentaria . Por ejemplo, en la industria láctea, se usa típicamente en la clarificación y desnatado de leche , extracción de nata, producción y recuperación de caseína , producción de queso , eliminación de contaminantes bacterianos, etc. Esta técnica de procesamiento también se usa en la producción de bebidas. , jugos, café, té, cerveza, vino , leche de soja , procesamiento / recuperación de aceites y grasas, manteca de cacao , producción de azúcar, etc. También se utiliza en la clarificación y estabilización del vino .

En laboratorios forenses y de investigación, se puede utilizar en la separación de componentes urinarios y sanguíneos . También ayuda en la separación de proteínas utilizando técnicas de purificación como la sal , por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio. La centrifugación también es una técnica importante en el tratamiento de residuos , siendo uno de los procesos más comunes utilizados para la deshidratación de lodos . Este proceso también juega un papel en la separación ciclónica , donde las partículas se separan de un flujo de aire sin el uso de filtros . En un colector ciclónico, el aire se mueve en una trayectoria helicoidal. Las partículas con alta inercia son separadas por la fuerza centrífuga mientras que las partículas más pequeñas continúan con el flujo de aire.

Las centrífugas también se han utilizado en pequeña medida para aislar compuestos más ligeros que el agua, como el aceite. En tales situaciones, la descarga acuosa se obtiene en la salida opuesta de la cual los sólidos con un peso específico mayor que uno son las sustancias objetivo para la separación.

Historia

En 1923, Theodor Svedberg y su alumno H. Rinde habían analizado con éxito los soles de grano grande en términos de su sedimentación gravitacional. Los soles consisten en una sustancia distribuida uniformemente en otra sustancia, también conocida como coloide . Sin embargo, los soles de granos más pequeños, como los que contienen oro, no pudieron analizarse. Para investigar este problema, Svedberg desarrolló una centrífuga analítica, equipada con un sistema de absorción fotográfica, que ejercería un efecto centrífugo mucho mayor. Además, desarrolló la teoría necesaria para medir el peso molecular. Durante este tiempo, la atención de Svedberg pasó del oro a las proteínas.

Hacia 1900, se había aceptado generalmente que las proteínas estaban compuestas de aminoácidos; sin embargo, aún se estaba debatiendo si las proteínas eran coloides o macromoléculas . Una proteína que se estaba investigando en ese momento era la hemoglobina . Se determinó que tenía 712 de carbono, 1130 de hidrógeno, 243 de oxígeno, dos átomos de azufre y al menos un átomo de hierro. Esto le dio a la hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16.000 dalton (Da) pero no estaba claro si este valor era un múltiplo de uno o cuatro (dependiendo del número de átomos de hierro presentes).

A través de una serie de experimentos que utilizan la técnica del equilibrio de sedimentación , se hicieron dos observaciones importantes: la hemoglobina tiene un peso molecular de 68.000 Da, lo que sugiere que hay cuatro átomos de hierro presentes en lugar de uno, y que no importa de dónde se aisló la hemoglobina, tenía exactamente el mismo peso molecular. La forma en que algo de una masa molecular tan grande se podía encontrar de manera consistente, independientemente de dónde se tomara la muestra en el cuerpo, no tenía precedentes y favoreció la idea de que las proteínas son macromoléculas en lugar de coloides. Para investigar este fenómeno, se necesitaba una centrífuga con velocidades aún mayores, por lo que se creó la ultracentrífuga para aplicar la teoría de sedimentación-difusión. Se determinó la misma masa molecular y la presencia de un límite de expansión sugirió que se trataba de una sola partícula compacta. La aplicación adicional de la centrifugación mostró que, en diferentes condiciones, las grandes partículas homogéneas podrían descomponerse en subunidades discretas. El desarrollo de la centrifugación supuso un gran avance en la ciencia de las proteínas experimentales.

Linderstorm-Lang, en 1937, descubrió que los tubos de gradiente de densidad podrían usarse para mediciones de densidad. Descubrió esto cuando trabajaba con el virus de la enana amarilla de la papa. Este método también se utilizó en el famoso experimento de Meselson y Stahl en el que demostraron que la replicación del ADN es semiconservativa mediante el uso de diferentes isótopos de nitrógeno. Utilizaron centrifugación en gradiente de densidad para determinar qué isótopo o isótopos de nitrógeno estaban presentes en el ADN después de los ciclos de replicación.

Ver también

• Centrífugo

Referencias

Fuentes