Imágenes de calcio - Calcium imaging

La formación de imágenes de calcio es una técnica de microscopía para medir ópticamente el estado de calcio (Ca ²⁺ ) de una célula , tejido o medio aislado . Las imágenes de calcio se aprovechan de los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca ²⁺ mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). Esta técnica ha permitido estudios de la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos de células. En las neuronas, la actividad eléctrica siempre va acompañada de un influjo de iones Ca ²⁺ . Por tanto, la formación de imágenes de calcio se puede utilizar para monitorizar la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos, lo que ha hecho posible diseccionar la función de los circuitos neuronales .

Indicadores químicos

Esquema de una configuración típica para imágenes de fluorescencia de calcio de miocitos cardíacos aislados

Los indicadores químicos son pequeñas moléculas que pueden quelar los iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo de EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad para los iones de calcio (Ca ²⁺ ) frente a los iones de magnesio (Mg ²⁺ ).

Este grupo de indicadores incluye fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 , calcio verde-1.

Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , con el fin de hacer que la molécula sea lipófila y permitir una fácil entrada en la célula. Una vez que esta forma del indicador está en la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación del éster acetoximetílico) también se puede inyectar directamente en las células a través de un microelectrodo o micropipeta que elimina las incertidumbres en cuanto al compartimento celular que contiene el colorante (el éster acetoximetílico también puede entrar en el retículo endoplásmico y las mitocondrias ). La unión de un ion Ca ²⁺ a una molécula indicadora fluorescente conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia o al desplazamiento de la longitud de onda de emisión / excitación . Los indicadores fluorescentes químicos de Ca ²⁺ individuales se utilizan para las mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. Las primeras imágenes de Ca ^{2+ en} tiempo real (velocidad de video) se llevaron a cabo en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de video intensificadas. El desarrollo posterior de la técnica el uso de láser de barrido microscopio confocal reveló Ca subcelulares ²⁺ señales en forma de Ca ²⁺ chispas y Ca ²⁺ blips. También se utilizaron respuestas relativas de una combinación de indicadores químicos fluorescentes de Ca ²⁺ para cuantificar los transitorios de calcio en orgánulos intracelulares como las mitocondrias .

Las imágenes de calcio, también conocidas como mapeo de calcio, también se utilizan para realizar investigaciones sobre el tejido miocárdico. El mapeo de calcio es una técnica ubicua que se utiliza en corazones enteros y aislados, como especies de ratones, ratas y conejos.

Indicadores de calcio codificados genéticamente

Los indicadores de calcio genéticamente codificables (GECI) son herramientas poderosas útiles para la obtención de imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. Los GECI no necesitan cargarse en celdas; en cambio, los genes que codifican estas proteínas pueden transfectarse fácilmente a líneas celulares. También es posible crear animales transgénicos que expresen el tinte en todas las células o selectivamente en ciertos subtipos celulares. Los GECI se han utilizado en estudios de neuronas, células T , cardiomiocitos , etc. En términos generales, los GECI se pueden dividir en clases en las que la detección de calcio se basa en fluorescencia o luminiscencia; sin embargo, ambos dependen inevitablemente de proteínas fluorescentes como indicadores, incluida la proteína verde fluorescente GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).

De las variantes fluorescentes, los sistemas indicadores de calcio se pueden dividir en sistemas de proteína fluorescente única (FP) y sistemas de proteína fluorescente emparejados. Camgaros fueron una de las primeras variantes desarrolladas que involucran un solo sistema de proteínas. Los canguros aprovechan la calmodulina (CaM), una proteína de unión al calcio. En estas estructuras, CaM se inserta en el medio de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en Y145. Estudios previos de mutagénesis revelaron que las mutaciones en esta posición conferían estabilidad de pH mientras se mantenían las propiedades fluorescentes, lo que hacía de Y145 un punto de inserción de interés. Además, los extremos N y C de YFP están unidos por un péptido enlazador (GGTGGS). Cuando CaM se une a Ca2 +, el pKa efectivo se reduce, lo que permite la desprotonación del cromóforo. Esto da como resultado un aumento de la fluorescencia tras la unión del calcio de forma intensiométrica. Esta detección contrasta con los sistemas radiométricos, en los que hay un cambio en los espectros de absorbancia / emisión como resultado de la unión de Ca2 +. Un sistema de FP único desarrollado posteriormente, denominado G-CaMP , también invoca GFP permutado circularmente. Uno de los extremos se fusiona con CaM y el otro extremo se fusiona con M13 (el dominio de unión a calmodulina de la miosina quinasa ligera). La proteína está diseñada de manera que los extremos estén cerca en el espacio, lo que permite que la unión de Ca2 + cause cambios conformacionales y modulación cromóforo, lo que permite una mayor fluorescencia. G-CaMP y sus variantes refinadas tienen valores nanomolares de afinidad de unión. Una última variante de proteína única es el CatchER, que generalmente se considera un indicador de menor afinidad. Su bolsa de unión al calcio es bastante negativa; La unión del catión ayuda a proteger la gran concentración de carga negativa y permite recuperar la fluorescencia.

En contraste con estos sistemas, hay sistemas de proteínas fluorescentes emparejados, que incluyen los cameleones prototípicos . Los cameleones constan de dos proteínas fluorescentes diferentes, CaM, M13 y un enlazador de glicilglicina. En ausencia de Ca2 +, solo la proteína fluorescente desplazada al azul del donante será fluorescente. Sin embargo, un cambio conformacional causado por la unión de calcio reposiciona la proteína fluorescente desplazada al rojo, lo que permite que tenga lugar FRET (transferencia de energía de resonancia de Forster). Los indicadores Cameleon producen una señal radiométrica (es decir, la eficiencia FRET medida depende de la concentración de calcio). Las variantes originales de los cameleones eran originalmente más sensibles al Ca2 + y se extinguieron con ácido. Tales deficiencias fueron anuladas por mutaciones Q69K y V68L. Ambos residuos estaban cerca del cromóforo aniónico enterrado y estas mutaciones probablemente impiden la protonación, lo que confiere una mayor resistencia al pH.

De creciente importancia en la detección de calcio son los GECI de IR cercano (NIR), que pueden abrir vías para multiplexar diferentes sistemas indicadores y permitir una penetración más profunda en los tejidos. Los NIR se basan en proteínas fluorescentes de unión a biliverdina, que se derivan en gran medida de fitocromos bacterianos . Los sistemas NIR son similares a los pericams inGCverse en que ambos experimentan una disminución de la fluorescencia tras la unión de Ca2 +. Los RCaMP y RGECO son funcionales a más de 700 nm, pero son bastante tenues y experimentan una alta dispersión. También se ha construido con éxito un análogo Cameleon que incluye NIR FRET.

Una clase especial de GECI está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable Eos que cambia de verde a rojo a través de la escisión de la columna vertebral fotocatalizada (con luz violeta). Combinada con la CaM, la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión dirigida a sinapsis de CaMPARI2.

Si bien los sistemas fluorescentes se utilizan ampliamente, los indicadores bioluminiscentes de Ca2 + también pueden tener potencial debido a su capacidad para anular la autofluorescencia, el fotoblanqueo [no se necesita longitud de onda de excitación], la degradación biológica y la toxicidad, además de una mayor relación señal / ruido. Tales sistemas pueden depender de la aequorina y la luciferina coelenterazina. La unión de Ca2 + provoca un cambio conformacional que facilita la oxidación de coelenterazina. El fotoproducto resultante emite luz azul cuando vuelve al estado fundamental. La colocalización de la aequorina con GFP facilita BRET / CRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia o quimioluminiscencia), lo que da como resultado un aumento de brillo de 19 - 65. Tales estructuras se pueden usar para sondear concentraciones de calcio de milimolar a nanomolar. Un sistema similar invoca la obelina y su coelenteramida luciferina, que puede poseer un tiempo de respuesta al calcio más rápido e insensibilidad al Mg2 + que su contraparte de la acueorina. Estos sistemas también pueden aprovechar el autoensamblaje de componentes de luciferasa. En un sistema denominado "nano-linterna", la luciferasa RLuc8 se divide y se coloca en diferentes extremos de CaM. La unión del calcio acerca a los componentes RLuc8, reformando la luciferasa y permitiendo que se transfiera a una proteína aceptor fluorescente.

Para minimizar el daño a las células visualizadas, a menudo se invoca la microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia de los reporteros. El uso de longitudes de onda de infrarrojo cercano y la minimización de la dispersión axial de la función de punto permite una resolución nanométrica y una penetración profunda en el tejido. El rango dinámico a menudo se determina a partir de tales mediciones. Para los indicadores no radiométricos (típicamente indicadores de proteína única), es la relación de las intensidades de fluorescencia obtenidas en condiciones de saturación y agotamiento de Ca2 +, respectivamente. Sin embargo, para los indicadores radiométricos, el rango dinámico es la relación entre el índice máximo de eficiencia FRET (saturado con calcio) y el índice mínimo de eficiencia FRET (sin calcio). Otra cantidad común que se usa para medir las señales producidas por los flujos de concentración de calcio es la relación señal / línea base (SBR), que es simplemente la relación del cambio en la fluorescencia (F - F0) sobre la fluorescencia de la línea base. Esto se puede relacionar con la SNR (relación señal / ruido) multiplicando la SBR por la raíz cuadrada del número de fotones contados.

Una clase especial de indicadores de calcio codificados genéticamente está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable mEos que cambia de verde a rojo cuando se ilumina con luz violeta. Combinada con el sensor de calcio calmodulina , la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión dirigida a sinapsis de CaMPARI2.

Uso

Independientemente del tipo de indicador utilizado, el procedimiento de obtención de imágenes es generalmente muy similar. Las células cargadas con un indicador, o que lo expresan en el caso de un GECI, pueden verse usando un microscopio de fluorescencia y capturarse con una cámara Scientific CMOS (sCMOS) o una cámara CCD . Los microscopios confocales y de dos fotones proporcionan capacidad de corte óptico para que las señales de calcio se puedan resolver en microdominios como espinas dendríticas o botones sinápticos , incluso en muestras gruesas como cerebros de mamíferos. Las imágenes se analizan midiendo los cambios de intensidad de la fluorescencia para una sola longitud de onda o dos longitudes de onda expresadas como una relación (indicadores radiométricos). Si es necesario, las intensidades y proporciones de fluorescencia derivadas pueden representarse gráficamente frente a valores calibrados para niveles conocidos de Ca ²⁺ para medir concentraciones absolutas de Ca ²⁺ . Los métodos de microscopía de campo de luz amplían la lectura funcional de las capacidades de actividad neuronal en volúmenes 3D.

Referencias

Otras lecturas

• Nuccitelli, Richard, ed. (1994). "Una guía práctica para el estudio del calcio en células vivas" . Métodos en biología celular. Boston: Prensa académica. ISBN 978-0-12-564141-8.