Electroforesis de afinidad - Affinity electrophoresis
La electroforesis de afinidad es un nombre general para muchos métodos analíticos utilizados en bioquímica y biotecnología . Se puede obtener información tanto cualitativa como cuantitativa mediante electroforesis de afinidad. Los métodos incluyen el denominado ensayo de cambio de movilidad electroforético , electroforesis de cambio de carga y electroforesis capilar de afinidad . Los métodos se basan en cambios en el patrón electroforético de moléculas (principalmente macromoléculas ) mediante interacción bioespecífica o formación de complejos . La interacción o unión de una molécula, cargada o no cargada, normalmente cambiará las propiedades electroforéticas de una molécula. Las proteínas de membrana pueden identificarse mediante un cambio en la movilidad inducido por un detergente cargado . Los ácidos nucleicos o fragmentos de ácidos nucleicos pueden caracterizarse por su afinidad por otras moléculas. Los métodos se han utilizado para estimar las constantes de unión , como por ejemplo en la electroforesis de afinidad de lectina o la caracterización de moléculas con características específicas como el contenido de glucanos o la unión de ligandos . Para las enzimas y otras proteínas de unión a ligandos, la electroforesis unidimensional similar a la contraelectroforesis o la "inmunoelectroforesis de cohete" , la electroforesis de afinidad puede usarse como una cuantificación alternativa de la proteína. Algunos de los métodos son similares a la cromatografía de afinidad mediante el uso de ligandos inmovilizados .
Tipos y métodos
Actualmente, existe una investigación en curso para desarrollar nuevas formas de utilizar el conocimiento ya asociado con la electroforesis de afinidad para mejorar su funcionalidad y velocidad, así como intentos de mejorar los métodos ya establecidos y adaptarlos para realizar tareas específicas.
Electroforesis en gel de agarosa
Un tipo de ensayo de cambio de movilidad electroforética (AMSA), la electroforesis en gel de agarosa se usa para separar los complejos de aminoácidos unidos a proteínas de los aminoácidos libres. Usando un voltaje bajo (~ 10 V / cm) para minimizar el riesgo de daño por calor, la electricidad pasa a través de un gel de agarosa.
Electroforesis rápida en gel de agarosa
Esta técnica utiliza un alto voltaje ( ≥ 20 V / cm ) con un tampón de Tris-borato 0,5 × corrido a través de un gel de agarosa. Este método se diferencia de la electroforesis en gel de agarosa tradicional al utilizar un voltaje más alto para facilitar un tiempo de ejecución más corto y producir una resolución de banda más alta. Otros factores incluidos en el desarrollo de la técnica de electroforesis rápida en gel de agarosa son el espesor del gel y el porcentaje de agarosa dentro del gel.
Electroforesis de afinidad por boronato
La electroforesis de afinidad por boronato utiliza geles de acrimida con infusión de ácido borónico para purificar el NAD-RNA. Esta purificación permite a los investigadores medir fácilmente la actividad cinética de las enzimas de desencadenamiento de NAD-RNA.
Electroforesis capilar de afinidad
La electroforesis capilar de afinidad (ACE) se refiere a una serie de técnicas que se basan en interacciones de unión específicas e inespecíficas para facilitar la separación y la detección mediante un enfoque de formulario de acuerdo con la teoría de la electromigración . Usando las interacciones intermoleculares entre moléculas que ocurren en solución libre o movilizadas sobre un soporte sólido, ACE permite la separación y cuantificación de concentraciones de analitos y constantes de unión y disociación entre moléculas. Con ACE, los científicos esperan desarrollar candidatos a fármacos de unión fuerte, comprender y medir la actividad enzimática y caracterizar las cargas de las proteínas. La electroforesis capilar de afinidad se puede dividir en tres técnicas distintas: electroforesis en no equilibrio de mezclas de muestras equilibradas, ECA de equilibrio dinámico y ECA basada en afinidad.
La electroforesis en desequilibrio de mezclas de muestras equilibradas se utiliza generalmente en la separación y el estudio de interacciones de unión de proteínas grandes e implica combinar tanto el analito como su molécula receptora en una muestra premezclada. Estas moléculas receptoras a menudo toman la forma de sondas de afinidad que consisten en moléculas marcadas con fluoróforos que se unirán a moléculas diana que se mezclan con la muestra que se está analizando. A continuación, esta mezcla y sus complejos posteriores se separan mediante electroforesis capilar. Debido a que la mezcla original de analito y molécula receptora se unieron en equilibrio, la disociación lenta de estas dos moléculas unidas durante el experimento electroforético dará como resultado su separación y un cambio posterior en el equilibrio hacia una mayor disociación. El patrón de frotis característico producido por la liberación lenta del analito del complejo durante el experimento se puede utilizar para calcular la constante de disociación del complejo.
El ECA de equilibrio dinámico implica la combinación del analito que se encuentra en la muestra y su molécula receptora que se encuentra en la solución tamponada en el tubo capilar, de modo que la unión y la separación solo ocurren en el instrumento. Para la electroforesis capilar de afinidad de equilibrio dinámico se supone que la unión ligando-receptor se produce rápidamente cuando se mezclan el analito y el tampón. Las constantes de unión se derivan generalmente de esta técnica basándose en el cambio de migración del pico del receptor que depende de la concentración del analito en la muestra.
La electroforesis capilar basada en afinidad, también conocida como cromatografía de electroafinidad capilar (CEC), implica la unión del analito en la muestra a una molécula receptora inmovilizada en la pared capilar, microperlas o microcanales. CEC ofrece la mayor eficacia de separación de las tres técnicas de ACE, ya que los componentes de la muestra no matriculados se eliminan por lavado y el ligando luego se libera y analiza.
La electroforesis capilar de afinidad aprovecha las ventajas de la electroforesis capilar y las aplica al estudio de las interacciones proteicas. La ACE es ventajosa porque tiene una alta eficiencia de separación, tiene un tiempo de análisis más corto, se puede ejecutar a pH fisiológico e implica un bajo consumo de ligando / moléculas. Además, no es necesario conocer la composición de la proteína de interés para realizar estudios de ECA. La principal desventaja, sin embargo, es que no proporciona mucha información estequiométrica sobre la reacción que se está estudiando.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con trampa de afinidad
La electroforesis en gel de poliacrilamida con trampa de afinidad (PAGE) se ha convertido en uno de los métodos más populares de separación de proteínas. Esto no solo se debe a sus cualidades de separación, sino también a que se puede utilizar junto con una variedad de otros métodos analíticos, como la espectrometría de masas y la transferencia Western. Este método utiliza un enfoque de dos pasos. Primero, se pasa una muestra de proteína a través de un gel de poliacrilamida usando electroforesis. Luego, la muestra se transfiere a un gel de poliacrilamida diferente (el gel de trampa de afinidad) donde se inmovilizan las sondas de afinidad. Las proteínas que no tienen afinidad por las sondas de afinidad pasan a través del gel de trampa de afinidad y las proteínas con afinidad por las sondas serán "atrapadas" por las sondas de afinidad inmóviles. Estas proteínas atrapadas se visualizan e identifican luego mediante espectrometría de masas después de la digestión en gel.
Electroforesis de afinidad por fosfato
La electroforesis de afinidad por fosfato utiliza una sonda de afinidad que consiste en una molécula que se une específicamente a iones fosfato divalentes en una solución acuosa neutra, conocida como "Phos-Tag". Este método también utiliza un gel de separación hecho de un monómero Phos-Tag pendiente de acrilamida que se copolimeriza. Las proteínas fosforiladas migran lentamente en el gel en comparación con las proteínas no fosforiladas. Esta técnica le da al investigador la capacidad de observar las diferencias en los estados de fosforilación de cualquier proteína dada.